红细胞免疫功能及其测定方法(精)

4 红细胞免疫功能的检测及其临床意义
4.1 红细胞C3b受体的测定
原理：红细胞膜上的C3b受体(CR1)可与补体致敏 的酵母菌粘附形成花环( RBC-C3bR花环 )；同时 红细胞膜上粘附的IC中C3b分子或抗原补体复合 物中的C3b分子可与未致敏的酵母菌的酵母多糖 粘附形成花环（ RBC-IC花环 ）。
具体操作程序：
在编号试管中分别加冷PBS 50 µl，加入鼠抗人红细胞 CR1(CD35)单抗1.5 µl及待测枸橼酸钠抗凝新鲜血0.5 µl， 充分吹打混匀，置室温下避光30 min。加入PBS液2 ml， 1500 r/min 离心5 min，弃上清液；加入荧光素标记的第二 抗体 — 羊抗鼠IgG-FITC 1 µl，吹打混匀，置室温下避光 30 min；再加入PBS液2 ml，充分混匀、洗涤，1500 r/min 离心5 min，弃去上清夜后加入PBS 300 µl，混匀后置流式 测试管中，严格按照流式细胞仪操作程序测定样品和对照 品，在计算机屏幕上显示或记录各待测标本红细胞平均荧 光强度。
（3）若这两项指标都上升，判断为红细胞天然免疫功能亢wk.baidu.com进与紊乱。
4.2 红细胞CR1数量的测定
4.2.1 红细胞CR1密度相关基因多态性测定方法
DNA提取
PCR扩增
限制性片段长度多态性酶切分析（RFLP分析）
琼脂糖凝胶电泳
4.2.2 红细胞CR1流式细胞仪测定方法
原理：单个红细胞CR1数量比白细胞CR1低，为 了提高试验的敏感度，采用间接免疫荧光染色 法流式细胞仪检测技术。用鼠抗人红细胞CR1单 抗与一定量待测纯红细胞数反应洗涤，再加羊 抗鼠IgG荧光标记抗体反应洗涤后，上流式细胞 仪测定，算出荧光染色红细胞平均强度，为红 细胞CR1数量指标。
意义：RBC-C3bR花环率和RBC-IC花环率可作为红细胞天 然免疫粘附功能的指标。
（1）若两项指标都低下，判为原发性红细胞免疫功能低下， 为红细胞膜C3b受体受到破坏或遗传基因缺陷及其他影响 所致。
（2）若RBC-C3bR花环率降低，而RBC-IC花环率增高，则 为继发性红细胞免疫功能低下，是由于红细胞CR1上免疫 复合物或补体调理的抗原量增加所致。
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1 红细胞与其它免疫反应细胞的比较
红细胞与其它血细胞均来源于骨髓造血干细胞。 以往认为虽然它们来源相同，但功能各异，前者 主要是运输气体，而后者则参与免疫和防御机制。 目前研究表明，红细胞不仅具有呼吸功能，且同 白细胞一样具有免疫功能。
2 红细胞的免疫功能
2.1 增强吞噬作用
纳尔逊(Nelson)用肺炎球菌和梅毒螺旋体等进行体外实验， 发现被相应抗体致敏的肺炎球菌或梅毒螺旋体，只有在 含补体、红细胞及白细胞的混合物中，80％～95％能迅 速被吞噬而从液相中消失；若缺少红细胞，则在较长时 间内仅有少数被吞噬。1956年Nelson又将抗体调理过的 肺炎球菌注入猴体内，获得的结果与体外实验相同，100 ％的肺炎球菌粘附于红细胞。
运用毛细管电泳的方法可以对正常红细胞和被病毒感染的 异常红细胞进行比较，以此来反映鉴定不同状态的细胞。
样品制备
1) 正常红细胞悬浮液 用含6%葡萄糖的0.1mol/L， pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释红 细胞，通过血球板计数法，确定细胞浓度为1.86×107个/ mL。
2) 异常红细胞悬浮液 取上述浓度红细胞0.2 mL与H1N1甲亚型流感病毒0.02 mL 充分混合，常温(25℃)下反应1ｈ。
3 红细胞免疫功能异常与疾病
近年研究证实在某些病理状态下，红细胞的免疫粘附活性 可发生改变。Siegel等检查了23名宫颈癌、胃癌和直肠癌 患者的红细胞免疫粘附功能，发现这些患者的红细胞粘附 抗原-抗体-补体复合物的能力较正常人显著降低。这一资 料提示在肿瘤的发展过程中，除可抑制白细胞免疫功能外， 还可抑制红细胞的免疫功能。
粘附的复合物较悬浮于血浆中游离的复合物更易被吞噬。 某些病毒在体内也能粘附于红细胞，从而被吞噬消灭。免 疫粘附可以增强吞噬作用4～5倍。红细胞还能阻止癌细胞 在循环中播散，因在外周血中癌细胞遇到红细胞比遇到白 细胞的机会多500～1000倍。当癌细胞表面结合有抗体与 补体时，则可通过红细胞表面的C3b受体，使癌细胞粘附 于红细胞，故容易被吞噬细胞捕捉与吞噬，从而防止癌细 胞的转移与扩散。
红细胞还有吞噬细胞样的功能，因为在其细胞膜表面具有 过氧化物酶，该酶是典型的溶酶体酶，它可起着巨噬细胞 样的杀伤作用。
2.2 红细胞的免疫粘附作用
免疫粘附是指抗原-抗体复合物与补体C3b结合后，可粘附 于灵长目或非灵长目的红细胞与血小板上，这一现象统称 为“血细胞免疫粘附作用”。红细胞的免疫粘附活性是通 过I型补体受体（complement receptor type I，CR1 )为基础 实现的。血循环中免疫复合物( IC )的清除主要由红细胞 CR1携带至肝脾网状内皮系统交给巨噬细胞消灭。CR1成 簇分布，人类每个红细胞大约表达200～500个CR1分子， 主要配体为C3b。该受体为糖蛋白，分子量为205 ，000。 红细胞上的C3b受体占血循环中C3b受体总数的95％以上。 因此，血循环中的抗原-抗体复合物遇到红细胞比遇到白 细胞的机会多500～1 000倍。
2.3 防御感染
红细胞与细菌、病毒等微生物免疫粘附后，不仅可以通过 过氧化物酶对它们产生直接的杀伤作用，而且还可以促进 吞噬细胞对它们的吞噬作用。因此，红细胞的免疫功能可 以看作是机体抗感染免疫的因素之一。
小结：目前已知红细胞具有以下免疫功能：(1)识别携带抗 原；(2)清除循环中免疫复合物；(3)增强T细胞依赖反应； (4)效应细胞样作用；(5)促进吞噬作用。而这些免疫功能 的生理学基础即为红细胞免疫粘附作用。
意义：红细胞CR1数量流式细胞仪测定结合CR1基因多 态性及红细胞CR1活性测定，对临床上红细胞免疫功能 缺陷与亢进分型更为客观，对临床辅助诊断及疗效指标 都具有重要应用价值。
4.2.3 红细胞CR1单抗免疫酶联法（ELISA法）
5 正常红细胞与异常红细胞毛细管电泳分离
能直接反映颗粒电性质的毛细管电泳具有高效、简便、灵 敏度高、样品消耗少等优点，在生化领域已经广泛应用于 蛋白质及其衍生物、肽类、氨基酸、糖类物质、无机离子、 手性物质等的分离与分析。
感染病毒后，在病毒作用下红细胞表面荷电量会 发生改变，致使细胞电泳速度和zeta电位发生改变。 实验证明，被病毒感染的红细胞与正常的红细胞 的出峰时间有明显的差别（被病毒感染的红细胞 出峰时间要比正常的红细胞出峰时间晚），且峰 形有了显著的变化。
细胞的电泳行为与细胞表面的电荷量直接相关， 而细胞表面的电荷量是由细胞膜上的生物大分子 的化学基团的离子化和表面吸附的离子决定的， 病变的细胞其表面成分发生改变，其带电性也有 所改变，因此通过检测细胞的电泳行为，了解细 胞损伤程度，有助于预测疾病的发生。
电泳条件
每天运行前用0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、水、缓冲 液分别洗柱3、6、3、3 min；每轮运行前均用0.1 mol/L NaOH 、水、缓冲液分别洗柱3、1、1 min；结束实验时 用0.1 mol/L HCl 、 0.1 mol/L NaOH和水分别洗柱5、10、 5 min，最后将毛细管内壁吹干保存。正极进样，负极检 测，均在室温下进行。进样压力3.448 kPa，进样时间5 s； 分离电压20 kV；紫外检测波长214 nm；分离温度25℃。
红细胞免疫功能及其测定方法
汇报人：王 翀
在肿瘤的发生发展过程中免疫功能起着重要的作用，过去的 观点认为免疫功能主要和白细胞有关，而红细胞在其中所起 的作用一直未受重视。1981年siegel提出了红细胞免疫系统的 新概念，开辟了机体免疫功能研究的新纪元。红细胞作为人 体血液有形成份的主要组成部分与肿瘤细胞的接触机会比其 他细胞要大1000倍。红细胞可以通过促吞噬作用、清除循环 免疫复合物( CIC )、效应细胞样作用及对淋巴细胞和细胞因 子的调控作用来达到抑制肿瘤的生长和转移的作用。在正常 情况下，红细胞免疫和白细胞免疫(如T细胞、B细胞、NK细 胞、巨噬细胞)在机体内相互联系、密切配合、协同作战，识 别和清除肿瘤细胞，共同维持机体内环境的平衡和生物功能 的稳定。
目前认为原发性癫痫和银屑病的发病也与自身免疫有关。 郭峰等曾观察到这两种疾病患者的红细胞免疫功能的变化 与 SLE 等其它自身免疫病患者是一致的。
另外，再生障碍性贫血的患者，其红细胞的免疫粘附作用 降低，可能是由于患者造血功能障碍，所产生的红细胞数 量少而且质量低劣，致使红细胞膜上的C3b受体生成不足。 慢性布氏菌病患者，其红细胞免疫功能亦降低，致使清除 感染因子的能力减弱，这种现象可能是引起该病经久不愈 的原因之一。
系统性红斑性狼疮（SLE）、类风湿性关节炎等自身免疫 性疾病，是因为患者体内针对自身组织发生免疫反应所致。 一般认为，自身免疫病患者的细胞免疫和/或体液免疫功 能处于相对增强状态。通过对此类病人红细胞免疫系统的 研究结果表明，其免疫功能亦明显增强，且与白细胞免疫 系统的功能改变相平行，这可能与自身免疫病患者血清中 存在着红细胞C3b受体活性抑制因子有关。