基因工程复习资料

1、基因工程（genetic engineering）：就是在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质（基因），在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA 分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地遗传给下代。

2、基本技术路线：分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（入宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）

3、基因工程的基本要素：目的基因、克隆载体、工具酶、受体细胞

4、载体(vector)：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

5、作为克隆载体必须具备的条件：至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。应有一个或几个限制性内切酶的单一识别位点，以供外源DNA的插入。应有一个或多个利于检测的遗传表型，易于识别和筛选。如抗药性、显色表型等，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。适当的拷贝数。

6、载体的分类：按载体的来源分：质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、植物病毒载体、动物病毒载体、人工染色体等。按用途分：克隆载体（clone vector）：主要用于扩增或保存DNA 片段，是最简单的载体，其上有复制子即可。表达载体（expression vector）：用于一个基因的蛋白表达，是在常规载体的基础上衍生而来，这类载体既有复制子，更要有强启动子。穿梭载体（shottle vector）：含有两个不同的复制子，能在两类不同的受体细胞中复制。

7、质粒载体的生物学特性：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的双链共价闭合的环状DNA分子，依赖宿主细胞的存在。

8、pBR322的优点：1、具有较小的分子量，4363bp 。2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号：Tetr Ampr 插入失活效应3、具有较高的拷贝数。

9、pBR322质粒的结构来源：来自pSCl01 的四环素抗性基因Tetr ；来自ColEl 的衍生物pMBl 的松弛复制起点ori ；来自pSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。

10、pUC18和pUC19载体的优点：具有较小的分子量（2.685 kb）和更高的拷贝数、抗氨苄青霉素、可进行蓝白斑选择、有MCS。

11、pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：（1）改进的pBR322的复制起点(ori) （2）Ap 基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点（3）lacZ`基因：大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码的α-肽链的DNA序列（4）在lacZ`基因内部靠近5`端有一段MCS区段。

12、筛选方法：插入失活，蓝白斑筛选，定向克隆。

13、λ噬菌体的结构特点：噬菌体结构：最常见的是具尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、线状体型。λ噬菌体的结构缺点：（1）基因组太大。（2）酶切点太多。如：它有5个EcoRⅠ位点，7个HindⅢ位点。（3）野生型只能接纳一定长度的DNA，相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45 kb的DNA。

14、λ噬菌体分子特点：（1）温和噬菌体，长度为48502 bp；（2）双链线性DNA；（3）具有cos位点，可以环化。 DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。

15、λ噬菌体的包装限制范围：正常野生型λDNA长度的75%—105%。只能容纳一定长度的DNA。36kb—51kb之间。插入的载体一定要有筛选标记。

16、插入型载体：外源DNA直接插入已构建载体中，如 gt10、 gt11、Charon6等。插入型载体只能插入较小的外源DNA片段（0-11kb)。

17、替换型载体：λDNA进一步去掉大多数的非必需片段，保留了作为载体的必需的左臂（含与包装蛋白有关的基因）和右臂（含与裂解生长有关的基因）。在左右臂间用一段填充片段替换了与溶源循环有关的基因片段。

18、λ-DNA载体的优点：λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌、λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为23kb，远远大于质粒的装载量、重组λ-DNA 的筛选较为方便。

19、柯斯质粒结构组成（5－7kb）：质粒的复制子抗药性基因几个限制性酶的单一位点cos序列和控制包装的序列。

20、柯斯质粒的优点：1）具有 噬菌体的特性：有λ噬菌体的高效感染能力2）具有质粒载体的特性：具有质粒复制子，在寄主细胞内能象质粒一样复制；具有抗生素的抗性基因，可作为筛选标记。3）有较高容量的克隆能力，30 - 45 kb

21、M13结构和组成特点：外型呈丝状，由外壳包装蛋白和正链DNA组成。不裂解宿主细胞，但抑制其生长。DNA全长6407个核苷酸，有11个基因。在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间有一个较长基因间隔区段，是外源基因插入的部位。

22、M13载体的优点：（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）Xgal显色反应，可供直接选择（3）无包装限制，克隆能力大（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链。子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。

23、M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：（1）闭合环状单链（+DNA）。（ssDNA）（2）复制型（RF）是双链环状DNA。（3）复制型DNA（RF DNA）和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌，并产生噬菌斑。（4）不存在包装限制。（5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。

24、人工染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。其装载外源DNA片段的容量可以与染色体的大小媲美。

25、YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒、酵母染色体的复制起点、酵母染色体的着丝粒、酵母系统的选择标记、大肠杆菌的复制子、大肠杆菌的选择标记。

26、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：定义：是一类能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。主要从原核生物中分离纯化出来。

27、1）同裂酶（isoschizomers）：来源不同，识别位点和切割位点均相同的限制性内切酶。即同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同裂酶对识别序列的甲基化状态有不同的限制性反应。2）同尾酶（isocaudamer）：来源不同，识别序列也不相同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。3）同位酶：识别序列相同，但切割位点不同。

28、限制性内切酶酶切反应的影响因素：1）酶切反应的温度不同的限制性内切酶具有不同的最适反应温度。大多数标准反应温度是37℃，但也有例外。如：Sma I 反应最适温度为25 ℃，Apa I则为30 ℃。2）限制性核酸内切酶缓冲液Tris-HCl（50 mM）pH 7.5、MgCl2 （10 mM ）、NaCl（0 - 150 mM ）、DTT（1 mM ）、BSA（100ug/ml）（少数反应需要）3）反应体积和甘油浓度50%甘油浓度做酶的保护剂，酶切反应时，酶的体积一般不超过总体积的10%，酶量过大，甘油浓度过高，影响酶切反应。4）酶切反应的时间大多数标准反应时间通（如：酶切基因组DNA时，则需要酶切过夜。）5）DNA的纯度和分子结构DNA的纯度：DNA样品中的一些杂质如氯仿、苯酚、乙醇、SDS、EDTA、蛋白等，都可能会影响酶的反应活性。所以，用于酶切的DNA样品应尽可能进行有针对性的纯化。解决办法：（1）增加限制性核酸内切酶的用量。（2）扩大酶催化反应的体积，使潜在的因素被相应的稀释。（3）延长酶催化反应的保温时间。DNA的分子结构：分子构型、位点偏爱性、识别序列的侧面序列、DNA的甲基化程度

29、部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全化的切割。导致部分酶切的原因：底物DNA的纯度低、酶的用量不足、反应缓冲液和温度不适宜、反应时间不足等。