手性色谱分析
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4
手性异构体在药理学效应上的差异
Pfeiffer规则：
对映异构体之间的生物活性存在着差异；
不同的对映体之间活性的差异是不同的；
当手性药物的有效剂量越低，即药效强度越高时，则对映体之间的药理作用的差别越大。
外消旋体和其两种单一对映体是不同的3种实体！
5
对映体与生物大分子的三点作用
手性分子的a、b、c三个基团与受体分子的活性作用点、、结合，是高活性对映体（优映体）。
烯类手性药物：衍生化成水性铂复合物。
24
手性固定相法（CSP）
原理：将手性试剂化学键合到固定相上与药物对映体反应形成暂时的非对映体对复合物，这种固定相称作CSP。
在CSP表面所形成的非对映体对，可根据其稳定常数不同而获得分离。（三点结合模型）
25
“三点相互作用”
●对映体和手性固定相之间，至少需要三个同时发生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个必须是立体化学相互作用。
发展趋势：
劣映体本身或其代谢物产生毒副作用，不再使用外消旋体。外消旋体转换成单一对映体，不仅提高质量，还延长药物寿命。
如：氧氟沙星的左旋异构体活性更强，左旋氧氟沙星临床使用剂量是消旋体的一半。
10
手性拆分（Chiral resolution）
对映体除了偏振光的偏转方向不同外，其它理化性质完全相同，因而分离难度大。
手性待测物必须具备反应活性基团，如胺基（-NH2），醇基（-OH），羧基（-COOH），以保证与CDR反应完全；
生成的非对映体光学稳定，柱效要高，能有效检测。
17
胺类对映异构体
异硫氰酸酯（ITC）
常用试剂有苯乙基异氰酸酯（PEIC）、2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC）。
流动相中可加入不超过5%有机溶剂。
29
分类
白蛋白柱（HSA、BSA）
糖蛋白柱：α1-酸糖蛋白柱（α1- AGP）
酶类
30
α1-酸糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构体
色谱柱为Chiral-AGP柱（150 mm×4.0 mm，5μm）
柱温为25℃；
流动相为50 mmol/L醋酸铵缓冲液（乙酸调pH至4.1），
广泛应用于氨基酸及其衍生物、麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等药物的分离分析。
18
GITC衍生化分离胺类对映异构体
反应原理
在三乙胺存在条件下进行，于乙腈、二氯甲烷或DMF中进行。
19
色谱分离和前处理条件优化
流动相组成和流动相pH对拆分的影响
（1）降低甲醇含量改善分离度，保留时间增加；
（2）未衍生化的羧酸基对pH值比较敏感。
●这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越大。
Y为S性手性选择剂，X为外消旋体
27
28
蛋白质类手性固定相
将蛋白质固定到硅胶上，利用蛋白质分子结构中的L-氨基酸提供手性作用位点与手性药物对映体产生不同ห้องสมุดไป่ตู้氢键作用、静电作用、疏水作用、离子对作用等达到手性拆分。
常用流动相为磷酸盐缓冲液（pH 4 ~ 7），
1
手性高效液相色谱法
*手性药物分析的概念
*常用手性高效液相色谱法
手性衍生化试剂法
手性固定相法
手性流动相添加法
2
手性的概念：一种镜像反射的对称性
3
手性分子：组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体。
分子结构中含有不对称碳原子是最常见的手性结构。
根据对偏振光的作用不同可分为R、S体，两者的等量混合物称之为消旋体。
（+）伪麻黄碱（-）伪麻黄碱
13
色谱条件：色谱柱：苯基柱150mm×4.6mm，I.D. 5mm；流动相：三乙胺-水（含50mmol·L-1磷酸二氢钾，磷酸调pH至4.0）-甲醇（0.01∶90∶10, v/v/v）；流速1.0 mL·min-1；检测波长：210nm；柱温：室温。
14
手性高效液相色谱法（Chiral HPLC)
衍生化时间及GITC用量的优化
（1）反应时间：10 min ~ 30 min
（2）用量：过量两倍
20
手性拆分结果
色谱条件：C18色谱柱，流动相：甲醇∶1%三乙基乙二氨四乙酸（TEAA缓冲）（pH = 5.5），检测波长254 nm；1 ml/min。
前处理：药物溶于含三乙胺乙腈水溶液，取50μl该溶液，加入50μl含2 g/L GITC的乙腈溶液，混合均匀后室温下放置10 min ~ 30 min，进样分析。
手性分子的a、b、c三个基团中只有a和b与受体分子的活性作用点和结合，是低活性对映体（劣映体）。
6
在未研究清楚两种单一对映体之间的生物学差异时，以消旋体给药往往会影响药物质量，甚至会严重损害人体健康。
“反应停”(Thalidomide)作为人工合成药，当时投入使用时是两种对映体的混合物。
7
反应停：五十年恩怨
21
拉贝洛尔的GITC衍生化
23
不同结构的药物衍生化策略
胺基类手性药物：运用异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（IC）类、手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化为酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲和磺酰胺。
羧基类手性药物：运用手性胺类衍生化试剂，将其衍生化为酯和酰胺。
醇类手性药物：运用手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化成酯。
手性色谱拆分方法：创造（或引入）手性环境，构造非对映异构体，使药物对映体间呈现理化特性的差异，从而实现药物对映体的色谱分离。.
11
组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体；不成镜像的分子，称之为非对映异构体，分子中所含手性碳越多，非对映异构体的数目越多.
非对映异构体
（-）盐酸伪麻黄
（-）麻黄碱（+）麻黄碱
●手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相关的三点相互作用的稳定状态，而另一对映体则只能两点作用形成不稳定状态。
●这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越大。
26
“三点相互作用”
●对映体和手性固定相之间，至少需要三个同时发生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个必须是立体化学相互作用。
●手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相关的三点相互作用的稳定状态，而另一对映体则只能两点作用形成不稳定状态。
手性衍生化试剂法（CDR）（分析物）
手性固定相法（CSP）（固定相）
手性流动相添加法（CMP）（流动相）
15
手性试剂衍生化法（CDR）
原理：
光学活性药物与有高光学纯度的手性试剂于分离前衍生化，在药物对映体中引入另外一个手性，形成非对映异构体，再以HPLC分析。
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手性反应注意事项
手性试剂为高光学纯度试剂，光学稳定性好：
手性异构体在药理学效应上的差异
Pfeiffer规则：
对映异构体之间的生物活性存在着差异；
不同的对映体之间活性的差异是不同的；
当手性药物的有效剂量越低，即药效强度越高时，则对映体之间的药理作用的差别越大。
外消旋体和其两种单一对映体是不同的3种实体！
5
对映体与生物大分子的三点作用
手性分子的a、b、c三个基团与受体分子的活性作用点、、结合，是高活性对映体（优映体）。
烯类手性药物：衍生化成水性铂复合物。
24
手性固定相法（CSP）
原理：将手性试剂化学键合到固定相上与药物对映体反应形成暂时的非对映体对复合物，这种固定相称作CSP。
在CSP表面所形成的非对映体对，可根据其稳定常数不同而获得分离。（三点结合模型）
25
“三点相互作用”
●对映体和手性固定相之间，至少需要三个同时发生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个必须是立体化学相互作用。
发展趋势：
劣映体本身或其代谢物产生毒副作用，不再使用外消旋体。外消旋体转换成单一对映体，不仅提高质量，还延长药物寿命。
如：氧氟沙星的左旋异构体活性更强，左旋氧氟沙星临床使用剂量是消旋体的一半。
10
手性拆分（Chiral resolution）
对映体除了偏振光的偏转方向不同外，其它理化性质完全相同，因而分离难度大。
手性待测物必须具备反应活性基团，如胺基（-NH2），醇基（-OH），羧基（-COOH），以保证与CDR反应完全；
生成的非对映体光学稳定，柱效要高，能有效检测。
17
胺类对映异构体
异硫氰酸酯（ITC）
常用试剂有苯乙基异氰酸酯（PEIC）、2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC）。
流动相中可加入不超过5%有机溶剂。
29
分类
白蛋白柱（HSA、BSA）
糖蛋白柱：α1-酸糖蛋白柱（α1- AGP）
酶类
30
α1-酸糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构体
色谱柱为Chiral-AGP柱（150 mm×4.0 mm，5μm）
柱温为25℃；
流动相为50 mmol/L醋酸铵缓冲液（乙酸调pH至4.1），
广泛应用于氨基酸及其衍生物、麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等药物的分离分析。
18
GITC衍生化分离胺类对映异构体
反应原理
在三乙胺存在条件下进行，于乙腈、二氯甲烷或DMF中进行。
19
色谱分离和前处理条件优化
流动相组成和流动相pH对拆分的影响
（1）降低甲醇含量改善分离度，保留时间增加；
（2）未衍生化的羧酸基对pH值比较敏感。
●这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越大。
Y为S性手性选择剂，X为外消旋体
27
28
蛋白质类手性固定相
将蛋白质固定到硅胶上，利用蛋白质分子结构中的L-氨基酸提供手性作用位点与手性药物对映体产生不同ห้องสมุดไป่ตู้氢键作用、静电作用、疏水作用、离子对作用等达到手性拆分。
常用流动相为磷酸盐缓冲液（pH 4 ~ 7），
1
手性高效液相色谱法
*手性药物分析的概念
*常用手性高效液相色谱法
手性衍生化试剂法
手性固定相法
手性流动相添加法
2
手性的概念：一种镜像反射的对称性
3
手性分子：组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体。
分子结构中含有不对称碳原子是最常见的手性结构。
根据对偏振光的作用不同可分为R、S体，两者的等量混合物称之为消旋体。
（+）伪麻黄碱（-）伪麻黄碱
13
色谱条件：色谱柱：苯基柱150mm×4.6mm，I.D. 5mm；流动相：三乙胺-水（含50mmol·L-1磷酸二氢钾，磷酸调pH至4.0）-甲醇（0.01∶90∶10, v/v/v）；流速1.0 mL·min-1；检测波长：210nm；柱温：室温。
14
手性高效液相色谱法（Chiral HPLC)
衍生化时间及GITC用量的优化
（1）反应时间：10 min ~ 30 min
（2）用量：过量两倍
20
手性拆分结果
色谱条件：C18色谱柱，流动相：甲醇∶1%三乙基乙二氨四乙酸（TEAA缓冲）（pH = 5.5），检测波长254 nm；1 ml/min。
前处理：药物溶于含三乙胺乙腈水溶液，取50μl该溶液，加入50μl含2 g/L GITC的乙腈溶液，混合均匀后室温下放置10 min ~ 30 min，进样分析。
手性分子的a、b、c三个基团中只有a和b与受体分子的活性作用点和结合，是低活性对映体（劣映体）。
6
在未研究清楚两种单一对映体之间的生物学差异时，以消旋体给药往往会影响药物质量，甚至会严重损害人体健康。
“反应停”(Thalidomide)作为人工合成药，当时投入使用时是两种对映体的混合物。
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反应停：五十年恩怨
21
拉贝洛尔的GITC衍生化
23
不同结构的药物衍生化策略
胺基类手性药物：运用异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（IC）类、手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化为酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲和磺酰胺。
羧基类手性药物：运用手性胺类衍生化试剂，将其衍生化为酯和酰胺。
醇类手性药物：运用手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化成酯。
手性色谱拆分方法：创造（或引入）手性环境，构造非对映异构体，使药物对映体间呈现理化特性的差异，从而实现药物对映体的色谱分离。.
11
组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体；不成镜像的分子，称之为非对映异构体，分子中所含手性碳越多，非对映异构体的数目越多.
非对映异构体
（-）盐酸伪麻黄
（-）麻黄碱（+）麻黄碱
●手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相关的三点相互作用的稳定状态，而另一对映体则只能两点作用形成不稳定状态。
●这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越大。
26
“三点相互作用”
●对映体和手性固定相之间，至少需要三个同时发生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个必须是立体化学相互作用。
●手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相关的三点相互作用的稳定状态，而另一对映体则只能两点作用形成不稳定状态。
手性衍生化试剂法（CDR）（分析物）
手性固定相法（CSP）（固定相）
手性流动相添加法（CMP）（流动相）
15
手性试剂衍生化法（CDR）
原理：
光学活性药物与有高光学纯度的手性试剂于分离前衍生化，在药物对映体中引入另外一个手性，形成非对映异构体，再以HPLC分析。
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手性反应注意事项
手性试剂为高光学纯度试剂，光学稳定性好：