谷氨酸发酵及工艺流程

谷氨酸发酵及工艺流程

一、准备阶段

1、菌种:谷氨酸产生菌BL-115

2、试剂:将40%尿素溶液、1%水解糖液、4%水解糖液分别装入流加瓶中,121℃15min备用

3、培养基:

(1)一级种子培养基:按下列培养基配方配1000ml一级种子培养基。按20%装液量分装后，于121℃灭菌30min冷却备用。

葡萄糖2.5%、尿素0.5%、硫酸镁0.04%、磷酸氢二钾0.1%、玉米浆2.5-3.5%、磷酸亚铁、硫酸锰各20ppm、pH7.0

(2)二级种子培养基：按下列培养基配方配制1000ml二级种子培养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121℃灭菌30min冷却备用。

水解糖2.5%、玉米浆2.5-3.5、K

2HPO

4

0.15%、MgSO

4

0.04、尿素0.4%、FeSO

4

2ppm、

MnSO

4

2PPm、pH6.8~7.0

(3)发酵培养基：按下列培养基配方制发酵培养基，并按70%装液量装于小型发酵罐中，离位灭菌，121℃实罐灭菌20min，冷却备用。

葡萄糖10%，蜜糖0.18-0.22%，玉米浆0.1-0.15%，Na

2HPO

4

0.17%，KCL 0.12%，

MgSO

4

0.04%，用NaOH溶液调pH7.20于110℃灭菌20min冷却备用。

4、仪器设备：摇床、显微镜、华勃氏呼吸器、分光光度计、蒸汽发生器、5L发酵罐、空压机等。

二、操作阶段

1、一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的一级种子培养基中（250ml三角瓶内接入1~2环）于32℃±1℃、250r.p.m条件下培养12h。

一级种子质量要求：种龄12h；pH6.4±0.1；光密度：净增O.D值0.5以上；无菌检查阴性，噬菌体检查无。

2、二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按0.5-1.0%接入上述以培养好的一级种子，于32℃±1℃、250r.p.m条件下培养7-8h，二级种子质量要求：种龄7-8h、pH6.8~7.2、OD值净增0.5左右无菌检查：噬菌体无、残糖消耗1%左右镜检：生长旺盛，排列整齐，G+

3、发酵生产操作：

（1）发酵液冷却至40℃左右时，通过蠕动泵加第一次尿素，添加量为0.8~1。0%。

（2）接种将前次实验制备的二级种子8-10%的接种量接入发酵罐。于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养35h

（3）发酵过程的控制

温度控制：谷氨酸发夹0~12h为长菌期，最适温度在30~32℃，发酵12小时后进入产酸期，控制34~36℃。由于发酵期代谢活跃，发酵罐要注意冷却，防止温度过高引起发酵迟缓。

pH控制：发酵过程中产物的积累导致pH下降，而氮源的流加导致pH的升高，发酵中当pH值进行控制既8h前pH7.0-7.6；8h后pH7.2-7.3，,20-24h期间pH7.0-7.1,24-35h期间pH6.5-6.6.尿素流加总量为4%

糖液流加：从第10h开始每隔4h补糖一次，每次补入1%的水解糖液，在发酵26h前补入4%的水解糖液。

发酵过程中，需注意完成下列工作

（1）注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在适合的范围内，遇有故障及时排除。

（2）每两小时取样一次，每次取样50ml，取样时，用量筒准确取流出的培养液50ml，对号倒入三角瓶中，封口，来不及测定的样液要立即放入冰箱保存（3）每2小时记录发酵过程温度、pH、OD、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。

（4）样液检测：对每份样液进行镜检，经单染后观察菌体形态；测定还原糖，测定菌体浓度。发酵结束后，用华勃氏呼吸器或其他方法测定发酵液中谷氨酸含量

（5）OD值测定方法：均匀取样5ml于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓

，根据菌体浓度与吸光度之间关系的标准曲线度，在721分光光度计上测定A

600

换算出菌体浓度；其余发酵于2000r/min条件下离心分离8min，上清夜入编号三角瓶，用于测糖

（6）还原糖测定：用菲林快速定糖法。

（7）菌体形态观察：革兰氏染色，油镜观察菌形、革兰氏染色结果以及有无杂菌污染

4、放罐

达到放罐标准后，及时放罐。经过发酵约35h后，后残糖在1%以下且糖耗缓慢或残糖＜0.5%，菌量增长（OD）值缓慢时，便可放罐，放罐操作同取样。排放液需灭菌处理才可进入下水道

5、清洗

放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电源

6、粗提

用浓硫酸将发酵液pH调至谷氨酸的等电点（pH3.15），用等电点法进行谷氨酸的粗提。