发光与金标实验

• ①发光的量子产率高 • ②能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物 • ③其化学发光常是氧化反应的结果 • ④在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性
微粒子酶免疫测定（MEIA）
• 原理：包被了抗CA153单克隆抗体的微粒子与
待测标本温育后，加入碱性磷酸酶（AP）标记的 抗CA153抗体，形成包被抗体-抗原-酶标记抗体 复合物，转移到玻璃纤维柱上，洗涤去除游离的 抗原、酶标抗体，加入底物(4-Mup)，脱磷酸后 形成甲基伞型酮(4-Mu)，在365nm激发光的照 射下，发出448nm的荧光，经过荧光读数仪的记 录、放大，计算出所测物质的含量。
美国雅培公司的AXSYM全自动快速 酶免疫分析系统
• 技术原理：MEIA、FPIA、ICIA • 标记物：碱性磷酸酶 • 包被技术：微粒子包被 • 分离技术：纤维网分离 • 发光剂：4－MUP • 发光诱导：酶催化底物发光 • 检测方法：夹心法和竞争法 • 检测速度：70T／h • 试剂位：20 • 灵敏度： 10－15 • 重复性：批内＜5％，批间＜10％
胶体金：氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏
血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的 金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称 为胶体金。
胶体金制备：0.01%HAuCl4溶液100ml，加热煮沸。
根据需要迅速加入1%枸橼酸三钠溶液4ml、2.5ml、1ml 或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的 胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。
胶体金特性
胶体金粒径(nm) 1%柠檬酸三钠量(ml)
16
2.0
24.5
1.5
41
1.0
71.5
0.7
呈色 橙色 橙红 红色 紫红
免疫金
• 免疫金：胶体金可以 和抗原、抗体、酶等 大分子蛋白结合而成 为免疫金
• 原理：胶体金颗粒表 面的负电荷与蛋白质 表面的正电荷通过静 电相吸附
金标记免疫技术
一例急诊HCG检测困惑
• 金标试纸检测该患者血清HCG呈弱阳性 • ACCESSⅡ检测血清HCG<0.5 mIU/ml
hCG金标与ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ光检测区别
金标：intact hCG 发光：hCG+β
α-β
血清hCG用金标试纸检测产生假阳性的猜想
• 金标因使用α-β模式，特异性下降。 • 一步法：未洗涤易产生非特异性吸附。 • 高浓度的RF；桥接固相抗体与示踪抗体。
• 【检测方法的局限性】 • 早早孕检测试剂仅用于体外诊断，适用于
检测尿中的HCG。
• HBsAg? • HIV-Ab?
化学发光免疫技术
• 分子发光定义：基态分子受到能量激发，吸收了一定 能量后，跃迁至激发态，激发态分子在很短时间内以 辐射跃迁（发光）形式释放能量并返回基态，便产生 了分子发光。
激发态
外部能量
光辐射 基态
• 根据激发方式不同，分子发光可分为 光致发光、生物发光、化学发光等。
化学发光剂
• 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光 子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或 发光底物。
标记免疫分析技术的分类
以示踪物的不同分类
酶免疫技术 荧光免疫技术 放射免疫技术 金标记免疫技术 化学发光免疫技术 时间分辨荧光免疫技术
微孔免疫技术 微珠（球）免疫技术 膜免疫技术
以固相载体的不同分类
固相载体
塑料 微颗粒 微孔滤膜
金标记免疫技术
氯金酸：Au+HNO3+4HCl=HAuCl4+NO+2H2O
• 免疫渗滤试验（穿流）
• 免疫层析试验（横流）
斑点金免疫层析试验
• 原理：被检尿样（含HCG）经虹吸通过胶体金标 记抗体（抗-βHCG）时，形成抗原抗体胶体金复 合物，复合物继续前行，通过测试区与包被的抗αHCG结合，形成双抗体夹心胶体金复合物，呈 现色带。过量的胶体金抗体继续前行，在参照区 形成胶体金二抗免疫复合物，呈现色带。