临床免疫学检验-课件-第6章-沉淀反应-2
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在琼脂内自由扩散，在一定区域内形成 可见的沉淀线/环, 常用于抗原定量分析。
2、双向琼脂扩散试验： 原理：琼脂内抗原、抗体各自向对方扩散，
在最适当的比例处形成抗原－抗体沉淀 线。常用于抗原、抗体定性分析。
一、单向琼脂扩散试验
(single gel diffusion test)
• 原理 将一定量的抗体混入 琼脂凝胶中，使待测抗 原在凝胶中自由扩散， 与相应抗体结合形成沉
•方法评价： 敏感度较低、简便、 快速、实用、只能 定性不能定量、缺
面上，当对应的抗原与 乏多对分辨力。
抗体相遇，在界面处形 •临床意义：
成清晰的乳白色沉淀环。 鉴定血迹、
诊断炭疽
操作步骤
环状沉淀示意图
环
状
沉
淀
示
意
图
•沉淀管内径1.5～2mm Ag •1～5min出现沉淀环为阳性 Ab •30min不出现沉淀环为阴性
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以 上,可见T3为直线，T1为反抛物线
将抗原作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的沉淀物 随抗原量的变化而不同。抗原抗体比例适当时，形成的沉淀物最多。
抗体稀释法：抗体最适比例
将抗体作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的 沉淀物随抗体量的变化而不同。
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
将以上两种方法结合，将抗原抗体同时稀释，找出最佳比例。
一、絮状沉淀试验 ( flocculation test)
• 原理
抗原溶液与相应抗体 溶液混合，在电解质存 在下，抗原与抗体结合 出现可见的絮状沉淀。
•操作步骤 •方法评价：
敏感度较低、简便、 易受抗原抗体比例 影响--最适比 •临床意义： 测定抗原抗体反应 的最适比。
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例
•一般选用多克隆抗体; 易出现可见反应 •对抗原抗体的比例要求高---选用R型抗体;常将 抗原作不同程度的稀释
凝集反应和沉淀反应的不同点
不同点
凝集反应
沉淀反应
抗原性质 颗粒性或可溶性抗 原致敏颗粒，呈颗 粒悬液
稀释对象 稀释抗体
观察现象 凝集块，液体变清
可溶性，大多呈 透明胶状溶液
稀释抗原 沉淀物
①凝胶呈网络状结构，可将水分固相化。 ②Ag、Ab在凝胶中可自由扩散。 ③扩散速度与分子大小相关：
小分子，扩散快；大分子，扩散慢。 可利用此点来识别待测物分子量的差别。 ④ Ag-Ab复合物分子量超过百万，被固定在凝胶 中相应位置。
• 凝胶内沉淀试验的类型： 1、单向琼脂扩散试验： 原理：凝胶中含一定量抗体, 加入抗原, 抗原
单向琼脂扩散试验抗原含量的计算方法：
1、Ｍancini曲线： • 适用范围：Ag为大分子,扩散时间(>48h),
用方格纸画曲线。 • 计算公式：c=kd2。
2、Ｆehey曲线： • 适用范围： Ag为小分子，扩散时间短(24h)。
用半对数坐标纸画线。 • 计算公式：logc=kd。
Mancini曲线
•操作步骤
•方法评价： 敏感度1.25mg/L、稳 定、简便、重复性和 线性均好
淀环，沉淀环大小与抗 •影响因素：
原浓度呈正相关。
1.抗体混于凝胶中 （沉淀环直径)2
2.抗原加入孔内
示意图
3.抗原自由扩散
标准品抗原浓度测定 不同病人抗原浓度测定
抗原浓度
1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找
相应抗原浓度
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
• 原理： 可溶性Ag和相应Ab在凝胶中扩散，形成 浓度梯度，在Ag与Ab浓度比例适当的位 置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
• 常用凝胶：琼脂(糖)。 • 琼脂(糖)：加热至100℃时融化，冷却至45℃时
重新凝固。 • 适宜浓度的凝胶可视为固相的液体，水分占98%
以上。
• 凝胶的特点：
絮状沉淀试验
絮 状 沉 淀 示 意 图 各管抗原倍比稀释
Ag
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
加入抗血清
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
源自文库
+
—
1/20
+
++ ++ ++ +++ ++
+
—
1/40
—
±
+
+
++ +++ ++
—
1/80
—
—
—
—
+
+
+
—
二、环状沉淀试验
(ring precipitation test)
• 原理
把抗原液小心地加于 已含抗体液的细试管液
沉淀反应
第一节 免疫沉淀试验的基本原理 第二节 液相免疫沉淀试验 第三节 凝胶内免疫沉淀试验 第四节 免疫沉淀试验的临床应用 第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素
基本原理
•沉淀反应:(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下
发生结合，出现肉眼可见的沉淀现象。 •沉淀反应中:
•可溶性抗原---沉淀原;抗体----沉淀素 •出现可见反应的时间长,易受多种因素影响
1898年Kraus首次发现毒素-抗毒素的沉 淀现象；
1905年Bechgold 发现沉淀可以在明胶中 进行；
1965年Mancini发明单向免疫扩散技术；
上世纪70年代免疫浊度法出现。
上述技术的发明发展，使得沉淀反应向 快速、准确、微量、自动化方向发展， 在医学检验中的应用越来越广泛。
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结合，快 形成肉眼可见的大的免疫
速但不可见。免疫比浊法 复合物。沉淀线或沉淀环
中的速率法就是利用此阶 的观察以及免疫比浊法中
段测定免疫复合物形成的 的终点法就是测定此阶段
速率。
形成的复合物
经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等 来判断结果，称为终点法需要几十分钟到数小时；
在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法。
沉淀反应的类型:
•液相内沉淀试验：指抗原抗体在以生理盐水 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 自由接触，短时间可出现反应。
•凝胶内沉淀试验：指琼脂糖内扩散或凝胶内 扩散试验。出现可见反应时间较长。
•免疫电泳 •免疫浊度
第二节 液相免疫沉淀试验
一、絮状沉淀试验:(flocculation test) 二、环状沉淀试验:(ring precipitation test)
2、双向琼脂扩散试验： 原理：琼脂内抗原、抗体各自向对方扩散，
在最适当的比例处形成抗原－抗体沉淀 线。常用于抗原、抗体定性分析。
一、单向琼脂扩散试验
(single gel diffusion test)
• 原理 将一定量的抗体混入 琼脂凝胶中，使待测抗 原在凝胶中自由扩散， 与相应抗体结合形成沉
•方法评价： 敏感度较低、简便、 快速、实用、只能 定性不能定量、缺
面上，当对应的抗原与 乏多对分辨力。
抗体相遇，在界面处形 •临床意义：
成清晰的乳白色沉淀环。 鉴定血迹、
诊断炭疽
操作步骤
环状沉淀示意图
环
状
沉
淀
示
意
图
•沉淀管内径1.5～2mm Ag •1～5min出现沉淀环为阳性 Ab •30min不出现沉淀环为阴性
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以 上,可见T3为直线，T1为反抛物线
将抗原作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的沉淀物 随抗原量的变化而不同。抗原抗体比例适当时，形成的沉淀物最多。
抗体稀释法：抗体最适比例
将抗体作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的 沉淀物随抗体量的变化而不同。
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
将以上两种方法结合，将抗原抗体同时稀释，找出最佳比例。
一、絮状沉淀试验 ( flocculation test)
• 原理
抗原溶液与相应抗体 溶液混合，在电解质存 在下，抗原与抗体结合 出现可见的絮状沉淀。
•操作步骤 •方法评价：
敏感度较低、简便、 易受抗原抗体比例 影响--最适比 •临床意义： 测定抗原抗体反应 的最适比。
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例
•一般选用多克隆抗体; 易出现可见反应 •对抗原抗体的比例要求高---选用R型抗体;常将 抗原作不同程度的稀释
凝集反应和沉淀反应的不同点
不同点
凝集反应
沉淀反应
抗原性质 颗粒性或可溶性抗 原致敏颗粒，呈颗 粒悬液
稀释对象 稀释抗体
观察现象 凝集块，液体变清
可溶性，大多呈 透明胶状溶液
稀释抗原 沉淀物
①凝胶呈网络状结构，可将水分固相化。 ②Ag、Ab在凝胶中可自由扩散。 ③扩散速度与分子大小相关：
小分子，扩散快；大分子，扩散慢。 可利用此点来识别待测物分子量的差别。 ④ Ag-Ab复合物分子量超过百万，被固定在凝胶 中相应位置。
• 凝胶内沉淀试验的类型： 1、单向琼脂扩散试验： 原理：凝胶中含一定量抗体, 加入抗原, 抗原
单向琼脂扩散试验抗原含量的计算方法：
1、Ｍancini曲线： • 适用范围：Ag为大分子,扩散时间(>48h),
用方格纸画曲线。 • 计算公式：c=kd2。
2、Ｆehey曲线： • 适用范围： Ag为小分子，扩散时间短(24h)。
用半对数坐标纸画线。 • 计算公式：logc=kd。
Mancini曲线
•操作步骤
•方法评价： 敏感度1.25mg/L、稳 定、简便、重复性和 线性均好
淀环，沉淀环大小与抗 •影响因素：
原浓度呈正相关。
1.抗体混于凝胶中 （沉淀环直径)2
2.抗原加入孔内
示意图
3.抗原自由扩散
标准品抗原浓度测定 不同病人抗原浓度测定
抗原浓度
1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找
相应抗原浓度
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
• 原理： 可溶性Ag和相应Ab在凝胶中扩散，形成 浓度梯度，在Ag与Ab浓度比例适当的位 置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
• 常用凝胶：琼脂(糖)。 • 琼脂(糖)：加热至100℃时融化，冷却至45℃时
重新凝固。 • 适宜浓度的凝胶可视为固相的液体，水分占98%
以上。
• 凝胶的特点：
絮状沉淀试验
絮 状 沉 淀 示 意 图 各管抗原倍比稀释
Ag
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
加入抗血清
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
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二、环状沉淀试验
(ring precipitation test)
• 原理
把抗原液小心地加于 已含抗体液的细试管液
沉淀反应
第一节 免疫沉淀试验的基本原理 第二节 液相免疫沉淀试验 第三节 凝胶内免疫沉淀试验 第四节 免疫沉淀试验的临床应用 第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素
基本原理
•沉淀反应:(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下
发生结合，出现肉眼可见的沉淀现象。 •沉淀反应中:
•可溶性抗原---沉淀原;抗体----沉淀素 •出现可见反应的时间长,易受多种因素影响
1898年Kraus首次发现毒素-抗毒素的沉 淀现象；
1905年Bechgold 发现沉淀可以在明胶中 进行；
1965年Mancini发明单向免疫扩散技术；
上世纪70年代免疫浊度法出现。
上述技术的发明发展，使得沉淀反应向 快速、准确、微量、自动化方向发展， 在医学检验中的应用越来越广泛。
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结合，快 形成肉眼可见的大的免疫
速但不可见。免疫比浊法 复合物。沉淀线或沉淀环
中的速率法就是利用此阶 的观察以及免疫比浊法中
段测定免疫复合物形成的 的终点法就是测定此阶段
速率。
形成的复合物
经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等 来判断结果，称为终点法需要几十分钟到数小时；
在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法。
沉淀反应的类型:
•液相内沉淀试验：指抗原抗体在以生理盐水 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 自由接触，短时间可出现反应。
•凝胶内沉淀试验：指琼脂糖内扩散或凝胶内 扩散试验。出现可见反应时间较长。
•免疫电泳 •免疫浊度
第二节 液相免疫沉淀试验
一、絮状沉淀试验:(flocculation test) 二、环状沉淀试验:(ring precipitation test)