流式细胞仪的应用

Annexin V Assay
细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻染色体局部凝聚
Annexin-V-FITC/PI双染法
由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸， 又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死 在其初期。细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生 红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光 产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色 荧光信号，正常活细胞与此相似。
Annexin-V-FITC/PI双染法
正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含 有带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，PS），而膜 外表面含有占绝大多数的中性磷脂。
在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内 部的PS迁移到细胞外层表面。Annexin V是一种 对Ca2+依赖，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白， 可作为探针识别细胞膜表面是否有PS，从而识别 凋亡细胞。
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Guava TUNEL
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Guava MitoPotential 线粒体膜电位
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细胞示踪
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Guava CellToxicity 细胞毒性：NK，CMC，ADCC
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Guava CellPaint 靶细胞监测
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Guava CellGrowth 细胞增殖：原代细胞
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细胞活力的检测
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞， 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。
CV是变异系数。一般CV越小， 峰形越好，越尖锐。能控制在 5%左右是比较好的结果，一般 小 于 10% 就 可 以 认 可 了 。
应用DNA含量测定鉴定细胞凋亡
如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也 称sub-G0期)
• 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA 含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光 强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内 切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细 胞内DNA含量下降造成的。
M G2
G1
s
G0 G0G1
C o u n t
0
s G2 M
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
G0 期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞，其细胞 DNA 含量为较恒定的2N值，G1期细胞与G0期细胞DNA值相同，均为二倍体 DNA含量，当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，当细胞DNA倍增结束，进 入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA 含量均为恒定的4N值，即为四倍体细胞群。
FasL
Apoptosis Signaling
Receptor
Mitochondrial
Fas
Staurosporine Camptothecin
FADD
Pro-caspase–8 Z–VAD
Active caspase–8
? DNA damage
Active
Bid +
Mitochondria
Pro-caspase–9 + Apaf-1 + Cyt c
ห้องสมุดไป่ตู้
在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化
早早期凋亡的检测---capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡---- “TUNEL”法 晚晚期凋亡-----DNA含量分析法
caspase-3
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重 要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子， 它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。 Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞 浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活， 活化的 Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基 （12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终 导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞， caspase-3的活性明显下降。
Dead Cell Discrimination
Cells should not be fixed/permeabilized prior to running on the flow cytometer. Cells are incubated on ice for 1 - 5 minutes in PI at a final concentration of 2ug/ml.
离心
两次
PBS
漂洗
37度消化1小时
2.5μl 10μg/μl RNase A
0.5ml PBS
悬浮细胞
过300目细胞筛
50μl 0.1mg/ml PI （含1%Triton)
混匀，室温 静止5分钟
上机
经RNA酶处理前后的比较
RNA也是核酸，也会被PI染色，为避免干扰,染色前需用RNAse降解RNA。这 样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。
在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为 （Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细 胞，为Annexin V+/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显 现Annexin V +/PI-。
Annexin V Assay 区分死亡与凋亡
Annexin V-PI Analysis
细胞周期分析
在细胞周期内DNA含量各时期发生周期性变化，通过 荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定，可分析细胞 周期各时期相对的百分比，了解细胞群体的倍体性和 增殖能力。 DNA含量常和某种细胞周期相关蛋白同 时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。
恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，DNA含量分析对 肿瘤的诊断预后有很高的价值,尤其对细胞毒性药物 的研究很有价值。
4 guava easyCyte™ 8HT 微毛细管细 胞分析仪
厂家：Millipore 获奖理由：突破性的微毛细管技术，无 需鞘液，样品体积少，废液更少，让细 胞分析变得更简单、快捷、易于操控
Guava 多种分析
Guava ViaCount 活细胞绝对计数
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Guava Cell Cycle 细胞周期分析
# Events
Flow Cytometry of Apoptotic Cells
Apoptotic cells Normal G0/G1 cells
PI - Fluorescence
缺乏IL-3诱导的细胞凋亡
在DNA直方图上区分凋亡峰和细胞碎片峰
上图为细胞碎片峰，在二倍体G0/1峰之前呈左高右低的抛物线（蓝色） 上图为细胞凋亡峰，在二倍体G0/1峰之前呈对称分布的抛物线（蓝色）
流式细胞术在生殖医学中的应用
精子细胞和精子为单倍体细胞1C ; 次级精母细胞为二倍体细胞2C; 初级精母细胞和处于G2M期的精原细胞4C
细胞凋亡分析
细胞凋亡
特点：染色质的浓缩, 核膜及细胞膜的内陷, 接 着核碎裂成分离的片段,凋亡小体(apoptosis body)的出现。
在流式细胞仪上，对于光散射特性观察凋亡细胞 的改变：由于细胞的固缩，体积变小，FSC会变小， 而细胞碎片及颗粒增多，SSC也会改变。
R3
R1
R4
R2
R3
R1
R4
R2
凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，利用凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒 （JC-1）进行检测，通过流式细胞仪分析分析结果。正常细胞{FL-1亮,FL-2 亮; R1}，凋亡细胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2}
早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡---- “TUNEL”法 晚晚期凋亡-----DNA含量分析法
Camptothecin:喜树碱，抗肿瘤药物
实验步骤
1. 离 心 收 集 悬 浮 细 胞 ， 微 量 离 心 机 转 速 2000RPM ， 离 心 时 间 5min，弃培养基。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。 3.用400ul 1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 106
A typical DNA Histogram of cell proliferation
G0-G1
G2-M
S
# of Events
Fluorescence Intensity
样品制备
1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞
PBS漂洗 70%酒精 两次 4度固定过夜
1000rpm 5分钟收集固定的细胞
Incubation with Camptothecin喜树碱 (hr)
0
0.5
1
2
4
Relative Cell Number
Active Caspase-3–FITC
早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡---- “TUNEL”法 晚晚期凋亡-----DNA含量分析法
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Guava Express Cell Surface Antigen Detection 细胞表面蛋白检测
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Guava RapidQuant 小鼠及人的IgG定量
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细胞凋亡
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Guava NexinAnnexin V结合
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Guava Caspase 3/7
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Guava Caspase 8
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Guava MultiCaspase
流式细胞仪的应用
主讲人：王银
流式细胞术在基础研究中的应用
细胞活力的检测 细胞周期分析 细胞凋亡分析 多药耐药基因研究（MDR） RNA测定、DNA测定 细胞内离子的测定及pH值测定
流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
结果解读
G0/G1期细胞占总的61.2%， 峰位于横座标的45.76
G2/M期占13.07，峰位于横座 标的91.43
S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍
体细胞，而G1期为2倍体细胞， 比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集 体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的） 为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为 17431个（即排除了碎片及聚 集体后）
cells/ml。 4.在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-
8°C避光条件下孵育15分钟。 5.加入10ul PI后轻轻混匀，于2-8°C避光条件下孵育5分钟。 6. 在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡---- “TUNEL”法 晚晚期凋亡-----DNA含量分析法
原理
细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区 别，根据细胞凋亡和坏死的形态特点，一 般认为在细胞坏死早期就会出现细胞膜通 透性及线粒体跨膜电位的改变，而在细胞 凋亡时这些改变的发生则要晚。一旦线粒 体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。
凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1） （JC-1 Apoptosis Detection Kit）
Z–VAD Active caspase–9
Pro-caspase–3 (6, 7) Active caspase–3 (6, 7)
Z–VAD
Massive substrate cleavage
DEATH
Flow Cytometric Analysis of Apoptosis in Jurkat T Cells
采用一种阳离子脂质荧光染料JC-1作为检测线粒体跨膜电位指示 剂。
JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存 在，高浓度时以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同，单体在流 式细胞仪绿色（FL-1）通道检测出绿色荧光，多聚体在流式细胞 仪红色（FL-2）通道检测出红色荧光。
JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的 膜电位（△y）具有极性，JC-1依赖于△y的极性被迅速摄入线粒 体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，发射红色荧光。而 细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释 放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。根椐 这一特征检测线粒体膜电位的变化。