流式细胞仪原理及应用精选课件

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20
(一) FCM在临床免疫学中的应用
1.评价机体的免疫功能 (1) 淋巴细胞亚群 ● T细胞： CD3+ CD4+ (Th/Ti) CD8+ (Ts/Tc) ● B细胞： CD19+ ● NK细胞：CD3- CD16+ CD56+
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21
(2) 淋巴细胞亚群细分 ● T细胞：Ts：CD8+ CD28Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ Ti：CD4+ CD45RA+ ● B细胞：B1：CD5+ CD19B2：CD5 + CD19+
600
800
1000
90 Degree Scatter
.
15
Immunophenotyping
HISTOGRAM 单参数直方图
0
15
0
11
0
Count
37
0
0
.1
1
10
100
1000
Log FITC
.
16
双参数直方图DOT PLOT
1
45%
2
2%
Hale Waihona Puke Baidu
100
10
1
.1
27% 3
26% 4
.1
1
10
100
LASER
SIGNAL PMT
AMP
computer
LIN
LOG
.
4
滤片
带通滤片 BAND PASS (BP)
只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
White Light Source
Transmitted Light
620 -640 nm Light
二向色性滤片 DICHROIC FILTER
放大部分 光电倍增管PMT HV 放大电路 GAIN 增益 线性：LIN 对数：LOG
统计：计算机
.
2
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
.
3
FLOW CYTOMETRY(FCM)
SAMPLE
3
PMT
2
Bandpass Filters
PMT
1
Laser
.
6
OPTICS
.
7
信号
荧光信号
FL1，FL2，FL3，FL4 线性，对数
散射光信号
前向散射光(FS)：细胞大小 侧向散射光(SS)：结构复杂程度
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8
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
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9
常用荧光染料的特性
激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97
粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f
内皮细胞 CD105 CD106 CD109
细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126
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19
流式细胞术的临床应用
临床免疫学 临床血液学 临床肿瘤学 血栓与止血 骨髓和器官移植 基础医学研究
流式细胞仪 FLOW CYTOMETER
原理及应用
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1
基本原理
光源 488nm兰绿色，15mW空冷，氩离子激光
流路 流动室(flow cell) 鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS • 无颗粒，无荧光本底 • 无菌，稳定的pH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
1000
Log FITC Fluorescence (CD8)
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17
CD分子(Cluster of differentiation) -------人类白细胞分
化抗原
1982年巴黎首届国际学术会议确定CD命名法 已有200多个分化抗原群被鉴定和命名 已得到WHO有关管理机关批准
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18
CD抗原及其相关细胞群
细胞群
CD抗原
T细胞
CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38
B细胞
CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75
髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35
NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94
血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63
Side Scatter Projection
ForwardScater rPjoection
ForwardScater
Scale
1000 200 100 50 40 30 20 15 8
200
400
600
800
1000
0
Neutrophils
Monocytes
Lymphocytes
0 200
400
.
23
(4) Ⅰ型变态反应介导分子 ● CD23： IgE低亲和力受体 ● 膜结合：IgE
(5) HLA类抗原 ● HLA-B7 / B-27 ● HLA-DR ● HLA-DP ● HLA-DQ ● HLA-ABC
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24
(6) 细胞因子受体 ● IL-2 Receptor (CD25) ● IL-12 Receptor ● EGF-Receptor ● TNF-Receptor ● TGFβ-Receptor ● Insulin-Receptor
一定波长以上通过，该波长以下折射
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg
Light Source
Transmitted Light
Reflected .
5
light
P4 MT
4
Flow Cytometry Principle
Flow cell
Dichroic
PMT
Filters
.
22
(3) 活化淋巴细胞亚群 ● 活化总T细胞： CD3+ /HLA—DR+ ● 静止总T细胞： CD3+ /HLA—DR● 活化CD4+细胞：CD4+ /HLA—DR+ ● 活化CD8+细胞：CD8+ /HLA—DR+ ● 活化诱导分子： CD69 ● 白细胞介素2低亲和力受体： CD25 CD25+ /CD3+：活化T细胞 CD25- /CD3+：静止T细胞
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光 深红
PI
488
620
DNA染色 橙红
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10
EPICS XL 流式细胞分析仪
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11
BECKMANCOULTER FLOW CYTOMETER
--------细胞分析领域中的CT 实现快速、高灵敏度、多参数的细胞功能分析
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12
细胞的特征与细胞功能
不同细胞的形态学特征 不同细胞的蛋白表达 其它细胞功能特征
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13
Immunophenotyping
CD4
CD # = cluster designation number
CD2
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14
Light Scatter Gating