流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
流式细胞仪的应用及工作原理
流式细胞仪的应用及工作原理流式细胞仪的应用流式细胞仪在医学应用特别广泛，是一种能够对细胞进行相关处理的仪器，并且能够对细胞进行必要的分析，所以在医同学的应用特别的多。
下面介绍一下流式细胞仪的实在应用：流式细胞仪的应用1、DNA倍体分析DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用广泛检测项目。
由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很讨论评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。
DNA含量检测还可供应细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。
特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。
这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培育中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。
全部方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。
在该领域Partec公司的 CyFlow PA是一枝独秀。
2、细胞生存本领试验使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。
3、计数外周血中检测网织红细胞使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。
4、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定。
使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE—CY5标记CD45抗体。
5、交叉淋巴细胞、粒细胞毒试验检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有侧紧要临床意义，由于这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。
流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。
FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE—CY5标记HLA抗体。
6、血小板自身抗体检测血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板削减症、输血后紫癜、难治性血小板削减。
流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪（Flow Cytometry）1 流式细胞仪的概念及其成长汗青1．1 流式细胞仪的根本概念流式细胞仪（flow cytonletry,FCM）是对高速直线流淌的细胞或生物微粒进行快速定量测定和剖析的仪器,重要包含样品的液流技巧.细胞的计数和分选技巧,盘算机对数据的收集和剖析技巧等.流式细胞仪以流式细胞术为理论基本,是流体力学.激光技巧.电子工程学.分子免疫学.细胞荧光化学和盘算机等学科常识分解应用的结晶.流式细胞术是一种主动剖析和分选细胞或亚细胞的技巧.其特色是：测量速度快.被测群体大.可进行多参数测量,即对统一个细胞做有关物理.生物化学特点的多参数测量,且在统计学上有效.1．2 流式细胞仪的成长简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年,Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管,在亮视野下用显微镜进行计数,并用光电记载装配测量的假想.1953年Crosland-Taylor依据牛顿流体在圆形管中流淌纪律设计了流淌室.厥后又经由Coulter.Parker & Horst.Kamentsky.Gohde.Fulwyler.Herzenberg等人的不竭改良,设计了光电检测装备和细胞分选装配.完成了盘算机与流式细胞仪的物理衔接及多参数数据的记载和剖析.首创了细胞的免疫荧光染色及检测技巧.推广流式细胞仪在临床上的应用.近20年来,跟着流式细胞仪及其检测技巧的日臻完美,人们越来越致力于样品制备.细胞标识表记标帜.软件开辟等方面的工作,以扩展FCM的应用范畴和应用后果.宋平根的《流式细胞术的道理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技巧阐述的最为详尽和透辟的中文著作.这本书平常具体地介绍了流式细胞术的汗青.构造.道理.技巧指标等,例举了其在医学和生物工程中的应用,平常合适从事此方面专业研讨的人.因为这本书是13年前出版的,所以根本上没有涉及植物流式细胞仪检测技巧.此外对于只须要对流式细胞仪有些根本熟悉的人士来说,这本书太庞杂太深邃.谢小梅重要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用.杨蕊归纳分解了流式细胞仪的工作道理,简略说起了流式细胞仪的应用.本文在剖析这三篇论著或文章的优缺陷后,用比较通俗的说话介绍了控制流式细胞仪检测技巧必须懂得的一些道理,并对今朝市场上的主流型号进行了客不雅的机能归纳分解.2 流式细胞仪的工作道理和技巧指标2．1 流式细胞仪工作道理除电源外,流式细胞仪重要由四部分构成：流淌室和液流体系：激光源和光学体系;光电管和检测体系;盘算机和剖析体系,个中流淌室是仪器的焦点部件.这四大部件配合完成了旌旗灯号的产生.转换和传输的义务.流淌室和液流体系流淌室由样品管.鞘液管和喷嘴等构成,经常应用光学玻璃.石英等透明.稳固的材料制造.设计和制造均很精致,是液流体系的心脏.样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力感化下从样品管射出;鞘液由鞘液管从周围流向喷孔,包抄在样品外周后从喷嘴射出.为了包管液流是稳液,一般限制液流速度υ<10m/s.因为鞘液的感化,被检测细胞被限制在液流的轴线上.流淌室上装有压电晶体,受到振荡旌旗灯号可产生振动.激光源和光学体系经特异荧光染色的细胞须要合适的光源照耀激发才干发出荧光供收集检测.经常应用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为广泛,也有配和氪离子激光器或染料激光器.光源的选择重要依据被激发物质的激发光谱而定.汞灯是最经常应用的弧光灯,其发射光谱大部分分散于300～400nm,很合适须要用紫外光激发的场合.氩离子激光器的发射光谱中,绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强,约占总光强的80%;氪离子激光器光谱多分散在可见光部分,以647nm较强.免疫学上应用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上,可应用染料激光器.将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱产生转变以顺应须要即构成染料激光器.例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm中断可调的激光,尤在590nm处转换效力最高,约可占到一半.为使细胞得到平均照耀,并进步分辩率,照耀到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径邻近.是以需将激光光束经透镜会聚.光斑直径d可由下式肯定：d=4λf/πD.λ为激光波长;f为透镜焦距;D为激光束直径.色散棱镜用来选择激光的波长,调剂反射镜的角度使调谐到所须要的波长λ.为了进一步使检测的发射荧光更强,并进步荧光讯号的信噪比,在光路中还应用了多种滤片.带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或经由过程.例如应用525nm 带通滤片只许可FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光经由过程.长波经由过程二向色性反射镜只许可某一波长以上的光线经由过程而将此波长以下的另一特定波长的光线反射.在免疫剖析中常要同时探测两种以上的波长的荧光旌旗灯号,就采取二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各类荧光离开.光电管和检测体系经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是经由过程光电转换器转变成电旌旗灯号而进行测量的.光电倍增管（PMT）最为经常应用.PMT的响应时光短,仅为ns数量级;光谱响应特点好,在200～900nm的光谱区,光量子产额都比较高.光电倍增管的增益从10到10可中断调节,是以对弱光测量十分有利.光电管运行时特殊要留意稳固性问题,工作电压要十分稳固,工作电流及功率不克不及太大.一般功耗低于0.5W;最大阳极电流在几个毫安.此外要留意对光电管进行暗顺应处理,并留意优越的磁屏障.在应用中还要留意装配地位不合的PMT,因为光谱响应特点不合,不宜交换.也有效硅光电二极管的,它在强光下稳固性比PMT好.从PMT输出的电旌旗灯号仍然较弱,须要经由放大后才干输入剖析仪器.流式细胞计中一般备有两类放大器.一类是输出旌旗灯号辐度与输入旌旗灯号成线性关系,称为线性放大器.线性放大器实用于在较小规模内变更的旌旗灯号以及代表生物学线性进程的旌旗灯号,例DNA测量等.另一类是对数放大器,输出旌旗灯号和输入旌旗灯号之间成经常应用对数关系.在免疫学测量中常应用对数放大器.因为在免疫剖析时常要同时显示阴性.阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1～2个数量级;并且在多色免疫荧光测量中,用对数放大器收集数据易于说明.此外还有调节便当.细胞群体散布外形不轻易受外界工作前提影响等长处.盘算机和剖析体系经放大后的电旌旗灯号被送往盘算机剖析器.多道的道数是和电旌旗灯号的脉冲高度相对应的,也是和光旌旗灯号的强弱相干的.对应道数年纵坐标平日代表发出该旌旗灯号的细胞相对数量.多道剖析器出来的旌旗灯号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件,或存贮于盘算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备挪用.盘算机的存贮容量较大,可存贮统一细胞的6～8个参数.存贮于盘算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处理和剖析,最后给出成果.除上述四个重要部特殊,还备有电源及紧缩气体等附加装配.2．1．1 旌旗灯号的产生.转换和传输在压力感化下,鞘液管中的鞘液被中断不竭地压入流淌室,形成一股稳固地中断的液流,包管了样本液稳固地处于鞘液液流的轴线上,并以单个细胞情势直线经由过程激光照耀区.激光照耀区又称测量区,是指液流与激光束垂直订交的点.当细胞携带荧光素标识表记标帜物（每种物质携带的标识表记标帜物不合吗?）经由过程激光照耀区时,产生代表细胞内部不合物质.不合波长的荧光旌旗灯号,这些旌旗灯号以细胞为中间,向空间360°立体角发射,产生散射光和荧光旌旗灯号.散射光不依附任何细胞样品的制备技巧,是以被称为细胞的物理参数或固有参数.散射光又包含前向角散射和测向角散射.前向角散射与被测细胞直径的平方亲密相干,测向角散射光对细胞膜.胞质.核膜的折射率更迟钝,可供给有关细胞内精致构造和颗粒性质的信息.荧光旌旗灯号也有二种;一种是细胞自身在激光照耀下发出的微弱荧光旌旗灯号,另一种是经由特异荧光素标识表记标帜后的细胞受激发照耀后得到的荧光旌旗灯号.在免疫剖析中常要同时探测两种以上波长的荧光旌旗灯号,就采取二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各类荧光离开.经荧光染色的细胞受到合适的光激发后产生的荧光是经由过程光电转换器转变成电旌旗灯号而进行测量的.最经常应用的光电转换器是光电倍增管（PMT）.从PMT输出的电旌旗灯号须要经由放大后才干输入剖析仪器.流式细胞仪中一般备有两类放大器.一类是线性放大器,其输出旌旗灯号与输入旌旗灯号成线性关系.线性放大器实用于在较小规模内变更的旌旗灯号以及代表生物学线性进程的旌旗灯号,如DNA测量等.另一类是对数放大器,其输出旌旗灯号和输入旌旗灯号之间成经常应用对数关系.在免疫学测量中常应用对数放大器.放大后的电旌旗灯号被传送到盘算机,再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件,保管在盘算机上.保管在盘算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和剖析.参数（例如：细胞的大小.形态.质膜和细胞内部构造）测量道理流式细胞仪可同时进行多参数测量,信息重要来自特异性荧光旌旗灯号及非荧光散射旌旗灯号.测量是在测量区进行的,所谓测量区就是照耀激光束和喷出喷孔的液流束垂直订交点.液流中心的单个细胞经由过程测量区时,受到激光照耀会向立体角为2π（360°）的全部空间散射光线,散射光的波长和入射光的波长雷同.散射光的强度及其空间散布与细胞的大小.形态.质膜和细胞内部构造亲密相干,因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射.折射等光学特点有关.未遭遇任何破坏的细胞对光线都具有特点性的散射,是以可应用不合的散射光旌旗灯号对不经染色活细胞进行剖析和分选.经由固定的和染色处理的细胞因为光学性质的转变,其散射光旌旗灯号当然不合于活细胞.散射光不但与作为散射中间的细胞的参数相干,还跟散射角.及收集散射光线的立体角等非生物身分有关.在流式细胞术测量中,经常应用的是两种散射偏向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）;②侧向散射（SSC）,又称90角散射.这时所说的角度指的是激光束照耀偏向与收集散射光旌旗灯号的光电倍增管轴向偏向之间大致所成的角度.一般说来,前向角散射光的强度与细胞的大小有关,对同种细胞群体跟着细胞截面积的增大而增大;对球形活细胞经试验标明在小立体角规模内根本上和截面积大小成线性关系;对于外形庞杂具有取向性的细胞则可能差别很大,尤其须要留意.侧向散射光的测量重要用来获取有关细胞内部精致构造的颗粒性质的有关信息.侧向散射光固然也与细胞的外形和大小有关,但它对细胞膜.胞质.核膜的折射率更为迟钝,也能对细胞质内较大颗粒给出敏锐反应.在现实应用中,仪器起首要对光散射旌旗灯号进行测量.当光散射剖析与荧光探针结合应用时,可辨别出样品中被染色和未被染色细胞.光散射测量最有效的用处是从非均一的群体中辨别出某些亚群.荧光旌旗灯号重要包含两部分：①自觉荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照耀后所发出的荧光;②特点荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照耀激光不合.自觉荧光旌旗灯号为噪声旌旗灯号,在多半情形下会干扰对特异荧光旌旗灯号的分辩和测量.在免疫细胞化学等测量中,对于结合程度不高的荧光抗体来说,若何进步信噪比是个症结.一般说来,细胞成分中可以或许产生的自觉荧光的分子（例核黄素.细胞色素等）的含量越高,自觉荧光越强;造就细胞中逝世细胞/活细胞比例越高,自觉荧光越强;细胞样品中所含亮细胞的比例越高,自觉荧光越强.削减自觉荧光干扰.进步信噪比的重要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料;②选用合适的激光和滤片光学体系;③采取电子抵偿电路,将自觉荧光的本底进献予以抵偿.2．1．2 流式细胞仪分选道理其实不是所有的流式细胞仪都具有分选功效.流式细胞仪的分选功效是由细胞分选器来完成的.由喷嘴射出的液流柱在电旌旗灯号感化下产生振动,断裂形成平均的小液滴.依据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,尔后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞经由过程静电场而产生偏转,落入收集器中.应用不合孔径的喷孔及转变液流速度,可能会转变分选后果.从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电须要一段延迟时光.精确测定延迟时光是决议分选质量的症结,可依据具体请求进行恰当调剂.2．1．3 数据的显示和剖析数据处理重要包含数据的显示和剖析.单参数直方图是应用最多的图形显示情势,既可用于定性剖析,又可用于定量剖析.单参数直方图是由X.Y二偏向构成的二维平面图.横座标X是所测的荧光或散射光的强度,用“道数”（Channel No．）来暗示.选择的放大器类型不合,标度不合.纵座标Y平日暗示被测细胞的绝对数量.正常情形下,数据剖析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图.对曲线图的说明应当具体问题具体剖析.除直方图外,数据显示方法还包含二维点图.二维等高图.假三维图和列表模式等.二维点图也是比较经常应用的数据显示类型.它显示两个自力参数与细胞相对数之间的关系,也是二维平面图,横纵坐标可以依据本身选定的被测参数自行决议,点的地位标清晰明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值.二维点图所供给的信息量要大于单参数直方图.数据剖析的办法大体可分为参数法和非参数法两大类.当被检测的生物学体系可以或许用某种数学模子时则多应用参数办法.非参数剖析法不必对显示的图像做任何假设,也不采取数学模子,剖析程序可以很简略,也可能很庞杂.临床医学较常应用非参数剖析法. 2．2 流式细胞仪机能的技巧指标流式细胞仪机能的技巧指标重要有荧光分辩率.荧光敏锐度.实用样品浓度.分选纯度等.荧光分辩率是指分辩两个相邻峰的最小距离,通经常应用变异系数（CV 值）来暗示.如今市场上主流型号出厂时的荧光分辩率应当小于2.0%.荧光敏锐度反应了仪器探测最小荧光光强的才能.一般用荧光微球上可测出的FITC的起码分子数来暗示.今朝仪器均可达到1000阁下.仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml.剖析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可剖析或分选的颗粒数量.一般剖析速度为5000～10000,分选速度控制在1000以下.流式细胞仪测量的数据是相对值,是以须要在应用前对体系进行校准或标定.流式细胞仪的校准有二个目标,即仪器的准直调剂和定量标度.平日应用尺度微球作为非生物学尺度样品,鸡血红细胞做为生物学尺度样品.3 主流流式细胞仪型号及其特点介绍今朝失去市场较大份额的公司是美国的BD（Becton-Dickinson）公司.Beckman-Coulter公司（原名称Coulter）和德国的Partec 公司.3．1 BD公司流式细胞仪介绍BD公司临盆的流式细胞仪都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter）,即荧光激活细胞分选器.其型号种类比较齐备,如早期的FACSort.FACS Canto.FACSean.如今市场上供给的型号有五种：FACSCount（小型流式细胞仪）.FACS CAlibur（流式细胞仪）.FACSA ria（流式细胞分选仪）.FACSV antage SETM（多色剖析和高速分选流式细胞仪）.LSR II（数字化剖析型流式细胞仪）.FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3,CD4,CD8绝对数而设计的.FACSCalibur是全主动多色流式体系,侧重于临床,其整体设计帮忙临床大夫快速实现通例免疫表型.CD4T细胞计数.DNA.网织红细胞.血小板等临床剖析,兼具分选功效.配备有二根激光管,可同时检测4个荧光参数.可辨认粘联细胞.BD FACSA ria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪,获取速度达70,000细胞/s,剖析速度达50,000/s.应用石英杯流淌检测池固定光路校准技巧.应用三种激光,多色剖析,剖析参数可达15色.两管或四管分选,可以应用多种规格的收集管.液流监测体系白动监测液流断点,检讨堵塞,实现了细胞分选的无人操纵.配件BDACDU装配,可以在微孔板或载波片上定量分选细胞.FACSV antage SETM是在FACSV antage的细胞分选功效基本上推出的分选加强型流式细胞仪.六色荧光剖析体系,点对点分选,设置装备摆设FACS Diva数字化体系,供给周全的配套试剂.速度和功效优于FACSV antage.BD LSR II是LSR的数字化进级版,其机能介于FACSV antage SE 和FACS Calibur之间,是专为性命科学研讨设计的台式机.配备固定校准的紫外激光,四种激光立体空间激发.十色荧光同时剖析.电子体系数字化.比较易学易用.3．2 Beckman-Coulter公司流式细胞仪介绍Beckman- Coulter 公司临盆的流式细胞仪以Profile（早期,现已停产）和EPICS系列为代表,近年又推出了Cytomics FC500系列.EPICS系列是大型流式细胞仪,今朝市场上有XL.XL-MCL和ALTRA三种型号,个中ALTRA具有分选功效,实用于免疫学.细胞心理.分子生物学.遗传学.微生物学.水质剖析和植物细胞剖析.Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小,可主动进行5种色彩的剖析,实用于免疫学检测,如人类HIV诊断.特殊是FC500MPL的奇特设计可以在统一体系上应用12×75mm的离心管和24或96孔的平板.特殊合适工作量大的试验室.这二个公司重要针对医学研讨和临床工作进行设计和临盆,其产品可应用于生物医学基本研讨以及临床检测的很多范畴,如遗传.肿瘤.血液.免疫等诸多研讨中红细胞.T细胞.淋巴细胞亚群测定.检测早期细胞凋亡.肿瘤细胞免疫测定等.这二个公司的流式细胞仪价钱昂贵,我国重要购置.应用的单位根本上都是一些医疗机构. 3．3 Partec公司流式细胞仪介绍与BD和Becman-Coutler公司的产品比拟,德国Partec公司临盆的流式细胞仪的配合特色是体积小,造价低,易操纵,便于携带,合适植物学研讨,合适遥远地区和成长中国度.德国Partec公司的产品分为三类：CCA家族.PAS 家族和CyFlow家族（Galaxy为早期产品,已停产）.CCA家族包含细胞计数剖析仪CCA和倍性剖析仪PA-I.它是单或双参数的台式小型机,可以进行一些通例剖析,如核DNA测定（检测倍性或细胞周期）.细胞计数.细胞凋亡.它的特色是体积小,易操纵,价钱低,检测规模广,可以检测多种荧光素（如PI.DAPI.Fluorescein）发出的荧光.PAS家族包含粒子剖析体系PAS.粒子剖析体系III （PAS-III）和倍性剖析仪PA-II.供给三种激光器的三种组合,可检测十余种荧光染料.最多可检测和记载八个自力荧光参数.倍性剖析仪PA可以或许在2分钟内主动测量植物的倍性程度,检测异倍体.可以对叶片.幼苗.种子.果皮.根.花等植物质料进行剖析.在大多半植物中,异倍体染色体的检测分辩率为±1条染色体.PA-I 应用HBO-100汞灯,属于弧光灯,可产生紫外激发光和蓝光.PA-II 中增长了488nm氩离子激光器,可以或许检测几乎所有的荧光染料,如DAPI,Hoeehst,PI,EB,MMC,FITC,FDA等.汞灯发光是电流经由气体时,气体电离产生的.它能供给最佳的激发波长.CyFlow（R）SL配备三种激光管,可应用于诸如人类健康.微生物学.工业应用.进程控制.生态学等研讨.如HIV扫描中免疫标识表记标帜细胞计数.食物处理进程中的微生物计数.细胞凋亡等.它应用l2 V直流电,特殊合适遥远地区和成长中国度.国际上20世纪80年月开端将流式细胞仪检测应用到植物的研讨中（Galbraith,1983）,浩瀚学者都以为流式细胞仪是一种精确.快速的检测DNA含量的办法（Michaelson,1991）.应用规模主如果应用流式细胞仪研讨属内.属间多栽种物的DNA含量（Baird,1994;Jacob,1996;HALL,2000）和倍性程度（Costich,1993;Meng,2002）.检测体细胞杂种（Pfosser,1995;Keller,1996）和游离小孢子造就再生株（Kim,2003）的DNA含量.曩昔我国应用这一检测技巧的植物研讨工作者寥若晨星,且大多是在国外试验室完成的.研讨内容包含植物心理.程序性逝世亡.倍性判定等.植物研讨中应用的流式细胞仪根本上都是Partec公司的产品,也有少量是BD公司临盆的流式细胞仪.BD公司的产品重要定位于医学研讨与应用,与Partec产品比拟,不太合适从事植物染色体倍性的判定.重要表如今不克不及供给植物样品制备技巧/试剂,数据获取软件可同时检测到的倍性数量少.鉴于今朝我国科研院所中应用较多的是BD公司临盆的流式细胞仪,鄙人一篇中将会对应用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技巧和技能做具体陈述.若何选择流式细胞仪自七十年月消失第一代流式细胞仪以来,跟着盘算机技巧.电子制造技巧.激光技巧及荧光素合成技巧的不竭成长,现代流式细胞仪已今非昔比,制造工艺.功效.精确度有了质的飞跃.流式细胞仪临盆厂商推出各类不合型号的流式细胞仪来知足用户的不合须要.现临盆流式细胞的厂商全球至少有六家,各厂商产品又有不合的系列,各具特色.若何从浩瀚的型号中遴选出最合适本身的机型,我们还需从剖析应用动身,评估本身的需求来决议什么样的流式细胞仪最具性价比.最合适本身.⑴.DNA倍体剖析DNA剖析是流式细胞仪最初且是如今应用最广检测项目.因为恶性细胞DNA含量平日与正常细胞不合,消失异倍体细胞,所以现有很研讨评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系.DNA含量检测还可供给细胞周期方面的信息,这在细胞生物学中应用很广泛.特殊地,它可暗示出细胞毒性药物对细胞感化进程.这些DNA检测还可与细胞概况标记物标识表记标帜同时进行,如许在细胞混杂造就中,可平日追踪表达特异标记物的细胞显示其发展周期情形.所有办法都是基于染料能与核酸起特异的化学反响并发射出荧光,经常应用的染料为PI,DAPI.流式细胞仪请求：488nm光源,575nm滤光片.⑵.细胞生计才能试验应用Heochest 33342染料与DNA特异性结合,后因细胞活气不合,。
流式细胞仪的原理和应用
流式细胞仪的原理和应用1. 引言流式细胞仪是一种常用于细胞分析和分选的实验室仪器。
它通过光学技术和流体力学原理，能够快速、准确地测量和分析细胞的各种参数。
本文将介绍流式细胞仪的原理和应用。
2. 原理流式细胞仪的工作原理主要包括以下几个部分：2.1 光学系统流式细胞仪通过激光束照射待测细胞，细胞内的荧光标记物被激发后会发出特定波长的荧光信号。
光学系统通过透镜、滤光片和光散射装置等光学元件，将细胞的荧光信号收集并转换为电信号。
2.2 流体力学系统流式细胞仪通过一个微细管道使细胞以单个细胞为单位通过检测区域。
流体力学系统通过控制细胞的流速和方向，确保细胞以适当的速度和位置通过激光束照射点，以确保准确的测量结果。
2.3 信号处理系统流式细胞仪的信号处理系统主要由放大器、模数转换器和计算机组成。
放大器将收集到的电信号放大到适当的范围，并将其转换为数字信号。
模数转换器将数字信号转换为计算机可以处理的数据，计算机则对这些数据进行分析和图像处理。
3. 应用流式细胞仪广泛应用于生物医学领域，常用于以下几个方面：3.1 免疫表型分析流式细胞仪可以通过检测细胞表面的特定标记物，如细胞膜上的抗原或细胞内的特定蛋白，来对细胞进行免疫表型分析。
这对于研究免疫系统、识别疾病标记物以及血液分析等应用具有重要意义。
3.2 细胞周期和凋亡分析流式细胞仪可以通过检测DNA含量的变化来研究细胞的分裂周期和凋亡过程。
这对于了解细胞生命周期、细胞增殖以及细胞死亡机制等方面的研究非常有帮助。
3.3 细胞分选与单细胞分析流式细胞仪还可以根据细胞的荧光信号和其他参数，对细胞进行分选。
通过设定合适的阈值，可以分别收集到不同亚群的细胞，从而进行后续的单细胞分析和研究。
3.4 体外受精和胚胎筛选流式细胞仪可以对体外受精过程中的精子和卵子进行分析和筛选，从而提高体外受精的成功率。
此外，对于胚胎的筛选和评估也可以使用流式细胞仪进行。
3.5 微生物学研究流式细胞仪对微生物的研究也具有重要意义。
九、流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免 疫荧光染色） 细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜）
Dynabeads技术计数CD4细胞
原理
用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分 离全血中CD4T淋巴细胞 将125ml新鲜血液，放入EDTA管，加350mlPBS，再加 入25ml mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去掉血液中的单核 细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS 洗涤2次，加入50ml Lysing溶液，着色，用 epifluorescent显微镜计数。
功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞； （2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
●流式细胞仪内部结构
▲光学系统 激光光源 光收集系统 ▲液流系统 流动室 液流驱动系统 ▲电子系统 光电转换 数据处理系统 ▲细胞分选系统
CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少
CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒臵，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损
外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、 预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方 案以及评价治疗效果的实验室标准指标。
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换
（面积，峰高，宽度）
流式细胞仪原理及其在CD 检测中 的的应用
• 市场占有率：全球75%，中国70%, 中国CDC95％以上
认识流式细胞仪——BD公司
BD公司流式细胞仪分为二大类： •一类为临床型（Clinic），其特点为仪器的光路 调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学 易掌握。BD公司的临床型FCM FACSCan也是最 早获得美国FDA批准可用于临床诊断的仪器。 •另一类为科研型（Research）,其特点为可快速 将所感兴趣的细胞分选出来，并且可将单个或指 定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上，并且 可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛 的科学研究应用。
FL1
FSC
FSC SSC
FL1
FL2
FL3
内容安排
• BD公司介绍 • 免疫学基础 • 流式细胞仪原理 • 流式细胞仪在CD4检测中的应用 • 绝对计数管在CD4检测中的应用 • MultiSET软件和手动圈门 • Q&A
淋巴细胞的免疫表型
CD19
T淋巴细胞的免疫表型
• T淋巴细胞分类复杂，不同类型免疫表型的T淋 巴细胞的功能不同
lymphocytes 66
运行软件
运行质控 调用条件
优化设置
获取数据
分析数据
关闭软件
• Specify data collection information (file name, storage location, panels, etc.).
• Click Acquire.
• Gate manually, if needed.
获取数据
分析数据
关闭软件
流式细胞仪原理深度讲解
流式细胞仪原理深度讲解流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。
它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。
一、流式细胞技术的应用1.其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；2.能准确地进行DNA倍体分析；3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；4.快速进行细胞分选和细胞收集；5.医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究；6 应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。
二、流式细胞仪的结构流式细胞仪（FCM）结构一般分为5部分：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测、存贮、显示、分析系统；细胞分选系统。
01流动室及液流驱动系统流动室（Flow chamber）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。
流动室充满鞘液，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等。
图：FCM的流动室和液流系统02激光光源与光束成形系统目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。
激光是一种相干光源，提供单波长、高强度、稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。
激光光束在达到流动室前，先经过透镜聚焦，形成稍大于细胞直径的光斑。
03光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。
在FCM的光学系统中主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3类：长通滤片（long-pass filter，LP）、短通滤片（short-pass filter，SP）及带通滤片（band-pass filter，BP）。
长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。
自己总结：流式细胞仪的原理和用途（五篇）
自己总结：流式细胞仪的原理和用途（五篇）第一篇：自己总结：流式细胞仪的原理和用途流式细胞仪（Flow Cytometry）流式细胞仪的概念及其发展历史1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。
流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。
流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。
其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。
1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。
1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。
其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。
近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。
宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。
这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。
由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。
1.流式细胞仪原理及其在CD4检测中 的的应用
光学系统
两种信号，6个参数
FSC SSC
散射光信号
FL1 FL2 FL3 FL4
荧光信号
光学系统
SSC
Incident Light Source
FSC
• FSC（前向角散射光） 代表细胞大小
• SSC（侧向角散射光） 代表细胞粒度
人外周全血经过红细胞裂解后
光学系统
携带有不同荧光染料的细胞通过激光激发，产生 不同的荧光信号
SSC Time FL1 Time FL2 Time FL3
Time
Parameter SSC FL1 FL2 FL3
Levels 150–999 Volts
认识流式细胞仪——总结
FL2 SSC FL1 Time FSC Time
Data Proce ssor
FSC SSC FL1
Time
Time
Platelets
T
B
பைடு நூலகம்
N K
Granulocytes
Monocytes
(Macrophages)
T Helper
T Cytotoxic
Basophils Neutrophils Eosinophils (Mast Cells)
CD分子-白细胞分化抗原
白细胞在分化成熟过程中 ，不同的发育阶段和不同 亚类的白细胞出现或消失 的表面标记，这是区分白 细胞的重要标志。1986年 世界卫生组织命名委员会 建议应用CD系列来统一命 名白细胞分化抗原
选）
检测平台——BD FACSCalibur
•单激光(488nm)
•三色
•五通道
机（可选）
检测试剂——BD FACSCalibur
流式细胞仪工作原理与应用范围
流式细胞仪工作原理与应用范围2008-11-01 10:30流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。
流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞仪的原理及应用
FACS Aria-高速 分选的台 式机
FACS Diva 高速分选的数 字化大型机
贝克曼-库尔特公司流式细胞仪产品
• FC 500 全自动分析仪
Gallios 双激光6色
EPICS ALTRA分析分选系统
AppliedBiosystems公司
• AttuneTM 声波聚焦细胞分析仪
流式细胞仪的临床免疫学应用
• 淋巴细胞免疫分型
• 细胞移植的交叉配型和免疫状
淋巴细胞亚群分析
态监测
CD4绝对计数 • HIV与SARS的诊断与研究
• 免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究
淋巴细胞CD4/CD8分析 淋巴细胞的增殖
CD4绝对计数
树突状细胞的研究
T细胞活化
• HLA-B27检测
淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞亚群分析
• 使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色 染色，同时对淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原 （CD分子）的表达进行分析，可以将淋巴细胞亚 群区分开，并定性分析；
• 淋巴细胞亚群的百分含量 • 淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析
临床意义
• 了解在不同情况下体内免疫功能状态 • 辅助临床疾病的诊断 • 探索疾病的发病机理、病程、预后 • 监测、指导临床治疗方案 • 免疫系统疾病 • 免疫缺陷病，AIDS • 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 • 肿瘤病人化疗后免疫力检测
淋巴细胞亚群分析
• 根据功能，淋巴细胞主要分为
B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关
光信号检测 散射光信号
CD4+T淋巴细胞绝对计数检测在孕妇胎儿畸形筛查中的应用
CD4+T淋巴细胞绝对计数检测在孕妇胎儿畸形筛查中的应用随着医学技术的不断进步，孕妇产前筛查已经成为孕期保健的重要环节之一。
产前筛查的目的是为了早期发现孕妇患有某些可遗传的遗传病和胎儿畸形，及时进行干预和治疗，有效降低孕妇和胎儿的风险。
近年来，科学家们发现CD4+T淋巴细胞绝对计数检测在孕妇胎儿畸形筛查中具有良好的应用价值，能够为孕妇提供更全面的胎儿健康信息。
本文将从CD4+T淋巴细胞绝对计数检测的原理、临床应用以及在孕妇胎儿畸形筛查中的意义等方面进行探讨。
一、CD4+T淋巴细胞绝对计数检测的原理CD4+T淋巴细胞是免疫系统中的一种重要细胞，它们在机体的免疫应答中发挥着重要作用。
CD4+T细胞可以帮助B细胞产生抗体，也可以协助CD8+T细胞杀伤感染性病原体。
CD4+T细胞的数量和功能异常与许多疾病的发生和发展密切相关。
CD4+T细胞绝对计数是指在一定体积的全血中，CD4+T细胞的绝对数量。
CD4+T细胞绝对计数检测是通过流式细胞仪等现代生物检测技术进行的，能够快速、准确地测定CD4+T细胞的数量，为医生提供了重要的诊断依据。
1. 诊断和监测艾滋病病毒感染：CD4+T细胞是HIV感染及艾滋病发病过程中的一个重要指标。
艾滋病病毒通过攻击CD4+T细胞来破坏机体的免疫系统，导致患者免疫功能丧失。
CD4+T细胞绝对计数检测可以帮助医生监测HIV感染者的免疫功能状态，指导治疗方案的制定。
2. 评价免疫功能状态：CD4+T细胞数量的增减与机体免疫功能状态密切相关，CD4+T细胞绝对计数检测可以帮助医生评价患者的免疫功能状态，为临床诊断和治疗提供重要参考。
3. 治疗效果监测：对于一些免疫相关性疾病，如风湿性关节炎、自身免疫性疾病等，CD4+T细胞绝对计数检测可以帮助医生及时监测治疗效果，指导治疗方案的调整。
近年来，研究发现CD4+T细胞在孕妇胎儿畸形筛查中具有较好的应用价值。
一方面，孕期胎儿发育过程中，CD4+T细胞数量的变化能够反映胎儿的免疫状态和发育情况；孕妇自身的免疫功能状态也会直接影响胎儿的健康。
流式细胞仪的原理与应用
流式细胞仪的原理与应用原理介绍流式细胞仪是一种常用于生命科学研究的仪器，用于对细胞进行高通量分析和计数。
它通过将悬浮细胞排列成单个细胞，然后利用激光照射细胞并检测产生的荧光或散射光信号，来获得关于细胞的多种信息。
流式细胞仪的原理包括以下几个关键步骤：1.细胞样本的制备：将细胞样品制备成单细胞悬浮液。
2.细胞的流式：将细胞悬浮液通过细胞流动系统，使细胞以单个细胞的形式通过激光束。
3.激光照射：使用激光束照射细胞，激发细胞产生荧光信号或散射光。
4.光信号检测：使用光学系统收集并分析细胞产生的荧光信号或散射光。
5.数据分析：将收集到的数据进行分析和解读，得出关于细胞的信息。
应用领域流式细胞仪广泛应用于生命科学相关的领域，包括以下几个方面：免疫学研究流式细胞仪可以用于研究免疫学领域的诸多问题。
通过标记特定的细胞表面分子，流式细胞仪可以定量和定性地分析细胞亚群的分布和表达水平。
例如，可以通过测量细胞表面抗原的表达来评估免疫细胞的激活状态。
此外，流式细胞仪还可以用于分析细胞因子的产生和分泌，从而揭示免疫响应的机制。
癌症研究流式细胞仪在癌症研究中起着重要的作用。
它可以用于检测和分析肿瘤细胞的特征。
通过染色或标记特定的肿瘤标志物，流式细胞仪可以帮助研究人员识别和定量肿瘤细胞，并对其进行分析。
此外，流式细胞仪还可以用于研究肿瘤细胞的增殖和凋亡过程，以及肿瘤细胞克隆和转移的机制。
神经生物学研究流式细胞仪在神经生物学研究中也有广泛应用。
通过使用特定的标记，可以对神经细胞或其他神经元亚群进行表型和功能研究。
例如，可以使用流式细胞仪来检测和分析特定神经细胞亚群的神经递质受体的表达水平，从而揭示神经细胞间相互作用的机制和功能。
细胞治疗流式细胞仪在细胞治疗中也有重要的应用。
细胞治疗是一种利用细胞修复和替代受损组织的方法。
流式细胞仪可以被用来富集和纯化特定的细胞亚群，以获取足够数量的细胞用于治疗。
此外，流式细胞仪还可以用于评估治疗的效果，例如通过分析细胞增殖或功能的变化来评估细胞治疗的效果。
流式细胞术的原理及临床应用介绍
流式细胞术的原理及临床应用介绍
一、引言
流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的细胞分析技术，它可以
通过对单个细胞的物理和化学特征进行检测以实现细胞的分类、计数、分析和分类。
本文将介绍流式细胞术的原理及临床应用。
二、原理
流式细胞术的原理是先将细胞溶液通过一系列的管道和阀门分别分离
和分离，然后将细胞与荧光染料或抗体等特异性标记物结合，使细胞
获得荧光性或表面标记，接着将细胞注入流式细胞仪，在流动的流体
中使细胞连续通过单一通道，荧光或标记在此过程中被依次检测。
最后，由计算机进行数据统计、分析和分类。
三、临床应用
1.癌症诊断和治疗监测
利用流式细胞术的高灵敏度和特异性，医生可以获得更准确的癌症诊
断结果，同时也可以监测病人的治疗状况和治疗进展情况，不仅可以
改善病人的生活质量，而且可以提高癌症治疗的疗效。
2.免疫学研究
流式细胞术可以用于深入了解整个免疫系统的结构和功能，包括淋巴
细胞、单核细胞和巨噬细胞等的生物学活动。
这可以帮助研究人员更
好地理解癌症等疾病的发生和发展机制，并根据这些机制来开展基于
流式细胞术的治疗方法。
3.病毒学研究
针对病毒学研究，流式细胞术已成为重要的工具。
通过仔细分析CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的活动和响应，我们可以更好地理解病毒感染的机制，也能够更好地评估疫苗效果。
四、结论
流式细胞术是一种高度灵敏和特异的细胞分析技术，在临床实践中得到了广泛的应用。
它在癌症诊断和治疗、免疫学研究和病毒学研究等领域都有很好的表现，为生物医学研究和治疗带来了巨大的进展。
流式细胞仪的原理及应用
流式细胞仪的原理及应用1. 导言流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种强大的生物学分析技术，可用于对细胞进行精确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞仪的原理以及其在不同领域中的应用。
2. 流式细胞仪的原理流式细胞仪通过激光器将单一细胞注入到来自样品的悬浮液中，并对其进行流式检测。
其原理主要包括以下几个步骤：2.1 细胞悬浮液的制备将待测样品进行预处理，并将细胞转化为单细胞悬浮液。
这通常涉及到细胞的离心、洗涤和溶解等步骤，以确保获得单一、可靠的细胞样本。
2.2 细胞的注射将细胞悬浮液注入流式细胞仪中，通过液压系统控制细胞的流速和数量，确保适量的细胞满足检测要求。
2.3 激光照射和荧光检测流式细胞仪使用高功率激光器照射经过细胞的细胞悬浮液。
这些激光器可以刺激样品中的荧光染料、标记物或其他荧光探针。
细胞在受到激光照射后会发出荧光信号，流式细胞仪则利用光电倍增管检测并记录这些信号。
2.4 数据分析流式细胞仪所得到的原始数据将通过计算机进行处理和分析，以提取相关的参数和信息。
数据可以按照细胞数量、细胞表型及细胞活性等不同参数进行分类和分析。
3. 流式细胞仪的应用3.1 生命科学研究流式细胞仪在生命科学领域的研究中扮演着重要角色。
它可以用于研究细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖以及细胞表型的分析。
流式细胞仪能够分析多个标记物的表达情况，帮助研究人员识别不同的细胞类型，并进行进一步的功能研究。
3.2 临床诊断流式细胞仪在临床诊断中也得到了广泛的应用。
它可以通过检测多种荧光标记物来识别和分类血液细胞，并进行疾病的诊断。
例如，在白血病的早期诊断中，流式细胞仪能够检测异常细胞的存在，提供重要的诊断依据。
3.3 免疫学研究流式细胞仪在免疫学研究中被广泛应用。
它可以辅助进行免疫表型分析、细胞介导的免疫反应监测以及细胞因子的检测。
流式细胞仪的高通量性能使得大规模分析成为可能，帮助研究人员深入了解免疫系统的功能和疾病的发展机制。
流式细胞仪基本原理和临床应用
Fluorescence Intensity
细胞凋亡检测技术
1 几个概念
2 技术和方法
1 荧光信号的面积：对荧光光通量 进行积分
2 DNA指数(DI)：相对DNA含量
3异倍体：非二倍体，包括近二倍 体，四倍体，多倍体，非整倍体
凋亡细胞的特点
➢ 在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核 膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器 密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲， 但早期细胞膜的完整性未受到破坏
流式细胞仪 分选系统
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
流式细胞 仪的应用
流式细胞仪的科研应用
➢ 细胞表型分析 ➢ 胞内细胞因子的检测 ➢ 染色体分类研究 ➢ 细胞周期和DNA倍体分析 ➢ 流式标准小球定量 ➢ 分选 ➢ 细胞内钙离子测量
流式细胞仪的光学系统
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过 聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上， 被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生 散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向 光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。 光散射信号在前向小角度进行检测，这种信 号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号 的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色 性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不 同波长的荧光信号。
号越强
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时,
受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物 质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可 分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统 计分析
流式细胞仪的技术原理及其在生命科学领域的应用
Excitation
300 nm 400 nm
500 nm
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
y
it
s
n
e
t
n
I
e
iv
t
la
e
R
DNA
PI
-38-
Allophycocyanin (APC)
Protein
632.5 nm (HeNe)
300 nm 400 nm
-55-
流式细胞仪应用软件
Cell Quest， BD公司FACS系列仪器系统操作和分析软件 流式细胞仪的各种工作状态设定，功能控制，样品检测，
获取和储存数据文件，样品数据文件的数据分析等功能，是 流式细胞仪技术的主要系统软件。
-40-
荧光信号
双色直接染色
-41-
Compensation （补偿）
-42-
Compensation （补偿）
-43-
Compensation （补偿）
-44-
二、流式细胞仪的工作原理和测量参数
（二） 流式细胞仪可检测的参数 2: 细胞参数
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周
-54-
流式细胞仪应用软件
主软件：
CELLQuest：样本获取，数据分析
仪器校正软件：
FACSComp：仪器自动校准，设定实验分析条件
临床应用自动软件：
SimulSET/MultiSET：淋巴细胞亚群计数分析，可报告T淋 巴细胞（T辅助细胞、T抑制细胞）、B淋巴细胞、NK淋巴细 胞含量，还可以报告绝对计数 ProCOUNT：干细胞计数分析，报告CD34+细胞绝对值 HLA-B27：自动测定全血HLA-B27 Retic-COUNT：网织红细胞计数
流式细胞仪原理及应用
流式细胞仪原理及应用流式细胞仪是一种用于细胞计数和表征的仪器，它基于细胞在流体中流动并通过光源的原理。
以下是流式细胞仪的原理和一些常见应用。
原理：1. 细胞准备：样品中的细胞首先需要进行适当的处理，包括细胞分离、去除细胞团块和杂质等，以确保流经流式细胞仪时的均匀性和准确性。
2. 细胞传递：样品中的细胞通过封闭的通道流动，形成单个细胞的串行排列，以便每个细胞能够单独接收光信号。
3. 激光照射：流式细胞仪使用激光器产生高强度的单色光束，照射到细胞上。
4. 光散射和吸收：细胞与经过的激光光束相互作用，发生光散射和吸收现象。
这些现象提供了关于细胞大小、形状、复杂度和细胞表面分子的信息。
5. 光信号收集：流式细胞仪使用多个光学组件和探测器来收集光信号。
不同的检测器可以收集不同的光散射角度和波长的光信号。
6. 数据分析：收集到的光信号通过计算机进行处理和分析，可以获得细胞的数量、计数、分类和细胞表面分子的信息。
应用：1. 细胞计数：流式细胞仪可以快速准确地计数细胞数量，并提供关于细胞浓度和细胞增殖的信息。
这在生物学研究和临床实验室中非常常见。
2. 细胞表征：通过测量细胞的大小、形状和表面标记物等特征，流式细胞仪可以对细胞进行表征，并帮助研究人员了解细胞类型和状态的变化。
3. 免疫细胞分析：流式细胞仪可以用于免疫学研究，如分析免疫系统中的不同细胞亚群、检测细胞表面抗原、测量细胞分泌物和研究细胞凋亡等。
4. DNA和蛋白质分析：通过使用荧光染料或抗体标记，流式细胞仪可以实现对DNA含量、染色体多样性以及特定蛋白质的定量和定位分析。
总之，流式细胞仪是一种功能强大的实验室工具，广泛应用于生物学、医学和药物研发等领域，为研究人员提供了大量有关细胞的信息。
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• 功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞数量的缺失，最 终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
CD4 T cells/ml
Infection
Seroconversion
1000
500 200
0 2-6 weeks
Flu-like Disease
HAART
Death
CD4 T cell depletion
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptom-atic
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为 进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
任意值 <200 <100 <75 <50
主要机会性感染的预防
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性） MAC
CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
B淋巴细胞 CD19+
T辅助/诱导细胞 CD3+CD4+
淋巴细胞
T淋巴细胞 CD3+
NK细胞 D3-CD16+56+
T抑制/细胞毒性细胞 CD3+CD8+
淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。 CD4+T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的维持具有枢纽
• 价格：3美元/人份
流式细胞术（flow cytometry, FCM）
流式细胞仪
BD-Calibur
BD FACSVantage
对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选
●FCM的特点
• 保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏 • 从分子水平获取多种信号 • 对细胞进行定量分析或纯化分选
CD4+T细胞 >350/mm3
病毒载量 任何值 任何值
建议 治疗 治疗
>30000（bDNA）或 建议治疗。另外还要根据CD4+T细
>55000(RT-PCR)
胞下降率和患者的愿望
<30000（bDNA）或 建议延迟治疗观察。未经治疗者3年
<55000(RT-PCR)
发展至AIDS<15%.
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化
CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少 CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒置，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损
外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、预测疾病进程、 制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案以及评价治疗效果的实验室标准指 标。
CMV（抗体阳性或血培养）隐球菌病组织胞浆菌 病球孢子菌病
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价
病程 症状期 无症状期 无症状期
无症状期
CD4+T淋巴细胞
任何值
CD4+T细胞 <200/mm3
CD4+T细胞 >200/mm3，但
<350/mm3
C D 4 ¸Ï û°ýÊ £¨ö¸ / u l ©£
VL log copies/ml
350
333
300
309
250
266
200
150
165
100
50
0 d0
4w
12w
ÖÎ ÁÆ Ê± ¼ä
24w
HAARTÖÎ ÁÆ 6¸ö Ô 10Àý »¼ Õß CD4ϸ ° û ƽ ¾ù Êý ± ä »¯
6
5
4
3
2
1
0
d0
4w
12w
24w
10例患者治疗期间平均VL的变化情况
提示
虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是单独的CD4+T细胞数 减少不是HIV感染的诊断检验。其它的免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细 胞数量减少的结果:
- 丙球蛋白缺乏症 - 胸腺发育不全 (DiGeorge氏综合症) - 严重的联合免疫缺陷
CD4+ T细胞计数的方法
非FCM 技术
优点
-简单 -低廉
缺点
-低通量 -难于质控
FCM 技术
优点
-自动化方法 -可靠性高(变异系数低) -精密度、准确度和可重复性高 -高通量 -金标准技术
缺点
-设备昂贵 -试剂昂贵 - 需要熟练技术人员操作
仪器的选择
1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞仪 （ FACSCalibur、Coulter)
• 免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免疫荧光染色） • 细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜）
Dynabeads技术计数CD4细胞
• 原理 • 用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分离全血中CD4T淋巴细 胞
• 方法 • 将125ml新鲜血液，放入EDTA管，加350mlPBS，再加入25ml mAbs磁化悬浮 粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去掉血 液中的单核细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS洗涤2次， 加入50ml Lysing溶液，着色，用epifluorescent显微镜计数。
phase
AIDS
成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，1993年）
CD4+T细胞
A 无症状或急性HIV感染或持 续性全身淋巴结肿大
临床阶段 B 出现症状，
不是A或C
>500/ul（≥29%）
A1
B1
200-499/ul （14-28%）
A2
B2
<200/ul（<14%）
A3
B3
C 艾滋病指针性症状 C1 C2 C3
2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪（ FACSCount、Guava) 3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如 Dynabeads） 4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议用总淋巴细胞
来代替。（当总淋巴细胞小于1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于 200 /ul。
非流式细胞技术