九流式细胞仪原理及应用CD绝对计数的原理方法和质量控制课件

CD4+ T细胞计数的方法
非FCM 技术
优点
-简单 -低廉
缺点
-低通量 -难于质控
FCM 技术
优点
-自动化方法 -可靠性高(变异系数低) -精密度、准确度和可重复性高 -高通量 -金标准技术
缺点
-设备昂贵 -试剂昂贵 - 需要熟练技术人员操作
仪器的选择
1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞 仪（ FACSCalibur、Coulter)
价格：3美元/人份
流式细胞术（flow cytometry, FCM）
流式细胞仪பைடு நூலகம்
BD-Calibur
BD FACSVantage
对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选
●FCM的特点
保持细胞及细胞器或微粒的结构及功 能不被破坏
从分子水平获取多种信号 对细胞进行定量分析或纯化分选
MAC CMV（抗体阳性或血培养）隐球菌病
组织胞浆菌病球孢子菌病
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价
病程
CD4+T淋巴细 胞
病毒载量
建议
症状期
任何值
任何值
治疗
无症状期
CD4+T细胞 <200/mm3
任何值
治疗
无症状期
CD4+T细胞 >200/mm3，但
成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，1993年）
临床阶段
CD4+T细胞 A 无症状或急性HIV感 染或持续性全身淋巴结 肿大
B 出现症状， 不是A或C
C 艾滋病指针性症 状
>500/ul （≥29%）
A1
200-499/ul （14-28%）
A2
<200/ul （<14%）
A3
B1
C1
B2
C2
维持具有枢纽的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞 数量的缺失，最终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
6
5
4
3
2
1
0
d0
4w
12w
24w
10例患者治疗期间平均VL的变化情况
提示
虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是 单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断检验。其它的 免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:
- 丙球蛋白缺乏症 - 胸腺发育不全 (DiGeorge氏综合症) - 严重的联合免疫缺陷
CD4绝对计数的原理、方法和 质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
淋巴细胞
B淋巴细胞 CD19+
T淋巴细胞 CD3+
NK细胞 CD3-CD16+56+
T辅助/诱导细胞 CD3+CD4+
T抑制/细胞毒性细胞 CD3+CD8+
淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。 CD4+T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的
HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化
CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少 CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒置，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损
外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、 预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方 案以及评价治疗效果的实验室标准指标。
2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪 （ FACSCount、Guava)
3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如 Dynabeads） 4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议
用总淋巴细胞来代替。（当总淋巴细胞小于 1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于200 /ul。
非流式细胞技术
Infection Seroconversion
HAART
CD4 T cell depletion
1000
Death
CD4 T cells/ml
500
200 0 2-6 weeks
Flu-like Disease
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptomatic phase AIDS
免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免 疫荧光染色）
细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜）
Dynabeads技术计数CD4细胞
原理 用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分 离全血中CD4T淋巴细胞
方法 将125ml新鲜血液，放入EDTA管，加350mlPBS，再加 入25ml mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去 掉血液中的单核细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计 分离，并用PBS洗涤2次，加入50ml Lysing溶液，着 色，用epifluorescent显微镜计数。
功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
B3
C3
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎 等）时，就可定义为进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
主要机会性感染的预防
任意值 <200 <100 <75
<50
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性）
<350/mm3
>30000（bDNA）或 >55000(RT-PCR)
建议治疗。另外还要根据 CD4+T细胞下降率和患者的 愿望
无症状期
CD4+T细胞 >350/mm3
<30000（bDNA）或 建议延迟治疗观察。未经治 <55000(RT-PCR) 疗者3年发展至AIDS<15%.
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
C D 4 ¸Ï û° ýÊ £¨ ö¸ / u l ©£
VL log copies/ml
350
333
300
309
250
266
200
150
165
100
50
0 d0
4w
12w
24w
ÖÎ ÁÆ Ê±¼ä
HAARTÖÎ ÁÆ 6¸ö Ô 10Àý »¼ Õß CD4ϸ °û ƽ ¾ù Êý ±ä »¯