九流式细胞仪原理及应用CD绝对计数的原理方法和质量控制课件
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流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。
2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3.10％FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
九流式细胞仪原理和应用CD四绝对计数的原理方法和质量控制课件
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化
❖ CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少 ❖ CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul） 主要机会性感染的预防
任意值 <200 <100 <75
<50
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性）
MAC CMV（抗体阳性或血培养）隐球菌
病组织胞浆菌病球孢子菌病
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
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CD4 T cells/ml
Infection Seroconversion
HAART
CD4 T cell depletion
1000
Death
500
200 0 2-6 weeks
Flu-like Disease
mean of 10 years
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HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
淋巴细胞
B淋巴细胞 CD19+
T淋巴细胞 CD3+
NK细胞 CD3-CD16+56+
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HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化
❖ CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少 ❖ CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul） 主要机会性感染的预防
任意值 <200 <100 <75
<50
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性）
MAC CMV（抗体阳性或血培养）隐球菌
病组织胞浆菌病球孢子菌病
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
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CD4 T cells/ml
Infection Seroconversion
HAART
CD4 T cell depletion
1000
Death
500
200 0 2-6 weeks
Flu-like Disease
mean of 10 years
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HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
淋巴细胞
B淋巴细胞 CD19+
T淋巴细胞 CD3+
NK细胞 CD3-CD16+56+
九、流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免 疫荧光染色） 细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜）
Dynabeads技术计数CD4细胞
原理
用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分 离全血中CD4T淋巴细胞 将125ml新鲜血液，放入EDTA管，加350mlPBS，再加 入25ml mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去掉血液中的单核 细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS 洗涤2次，加入50ml Lysing溶液，着色，用 epifluorescent显微镜计数。
功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞； （2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
●流式细胞仪内部结构
▲光学系统 激光光源 光收集系统 ▲液流系统 流动室 液流驱动系统 ▲电子系统 光电转换 数据处理系统 ▲细胞分选系统
CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少
CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒臵，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损
外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、 预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方 案以及评价治疗效果的实验室标准指标。
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换
（面积，峰高，宽度）
《流式细胞仪》课件
便携式设备的应用
将流式细胞仪的设备体积继续缩小， 大量应用于生物界的基础研究以及 医学检测和移动采样等领域。
流式细胞仪的市场前景评估
1 市场规模
2 主要厂商
3 市场推动因素
流式细胞仪市场规模呈自上 世纪六十年代发明起逐年扩 大的趋势，预计到2027年达 到40亿美金。
Becton, Dickinson and Company、Beckman Coulter、 Merck Millipore等公司产品 市场占领率较高。
灯源
氙气灯、汞灯、钨丝灯等不同的光源都可以被用作流式细胞仪的光源，不同灯源在功率、波 长、寿命等方面存在差异。
探测器的选择
1
荧光检测器
是流式细胞仪检测系统的关键组成部分，不同的检测器可以检测不同的荧光参数， 如细胞大小、细胞形态、细胞核酸含量等。
2
散射检测器
散射检测器可检测颗粒的大小和光密度信息，如侧散射检测器用于检测细胞的大 小和形态，前散射检测器检测颗粒的光密度信息。
3 准确记录
记录样品来源、批号和实验日期等信息，并保证实验室干净卫生。
样本的处理与染色
细胞损伤
避免长时间的离心和过滤，防止 细胞的膜破坏和凋亡。
细胞处理
使用重组蛋白等方法对细胞进行 特定功能标记的处理。
荧光染色
使用专门的生物染料与细胞反应 后，在流动细胞仪中检测荧光信 号。
流式细胞仪的参数设置
软件设置
流式细胞仪最早由韦斯利·莱恩和墨菲博士等人于1965年开发。自此以后，它经历了巨大的 技术发展和应用范围的扩大。
用途
流式细胞仪可应用于人类疾病的研究、药物开发、医学诊断、基因工程、环境监测等领域。
流式细胞仪的原理
流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
• 功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞数量的缺失，最 终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
CD4 T cells/ml
Infection
Seroconversion
1000
500 200
0 2-6 weeks
Flu-like Disease
HAART
Death
CD4 T cell depletion
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptom-atic
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为 进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
任意值 <200 <100 <75 <50
主要机会性感染的预防
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性） MAC
CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
流式细胞仪的原理及应用
• FACS Vantage SE大型分选机
FACS Aria-高速 分选的台 式机
FACS Diva 高速分选的数 字化大型机
贝克曼-库尔特公司流式细胞仪产品
• FC 500 全自动分析仪
Gallios 双激光6色
EPICS ALTRA分析分选系统
AppliedBiosystems公司
• AttuneTM 声波聚焦细胞分析仪
流式细胞仪的临床免疫学应用
• 淋巴细胞免疫分型
• 细胞移植的交叉配型和免疫状
淋巴细胞亚群分析
态监测
CD4绝对计数 • HIV与SARS的诊断与研究
• 免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究
淋巴细胞CD4/CD8分析 淋巴细胞的增殖
CD4绝对计数
树突状细胞的研究
T细胞活化
• HLA-B27检测
淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞亚群分析
• 使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色 染色，同时对淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原 （CD分子）的表达进行分析，可以将淋巴细胞亚 群区分开，并定性分析；
• 淋巴细胞亚群的百分含量 • 淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析
临床意义
• 了解在不同情况下体内免疫功能状态 • 辅助临床疾病的诊断 • 探索疾病的发病机理、病程、预后 • 监测、指导临床治疗方案 • 免疫系统疾病 • 免疫缺陷病，AIDS • 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 • 肿瘤病人化疗后免疫力检测
淋巴细胞亚群分析
• 根据功能，淋巴细胞主要分为
B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关
光信号检测 散射光信号
FACS Aria-高速 分选的台 式机
FACS Diva 高速分选的数 字化大型机
贝克曼-库尔特公司流式细胞仪产品
• FC 500 全自动分析仪
Gallios 双激光6色
EPICS ALTRA分析分选系统
AppliedBiosystems公司
• AttuneTM 声波聚焦细胞分析仪
流式细胞仪的临床免疫学应用
• 淋巴细胞免疫分型
• 细胞移植的交叉配型和免疫状
淋巴细胞亚群分析
态监测
CD4绝对计数 • HIV与SARS的诊断与研究
• 免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究
淋巴细胞CD4/CD8分析 淋巴细胞的增殖
CD4绝对计数
树突状细胞的研究
T细胞活化
• HLA-B27检测
淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞亚群分析
• 使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色 染色，同时对淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原 （CD分子）的表达进行分析，可以将淋巴细胞亚 群区分开，并定性分析；
• 淋巴细胞亚群的百分含量 • 淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析
临床意义
• 了解在不同情况下体内免疫功能状态 • 辅助临床疾病的诊断 • 探索疾病的发病机理、病程、预后 • 监测、指导临床治疗方案 • 免疫系统疾病 • 免疫缺陷病，AIDS • 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 • 肿瘤病人化疗后免疫力检测
淋巴细胞亚群分析
• 根据功能，淋巴细胞主要分为
B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关
光信号检测 散射光信号
流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件
4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞仪分析技术及应用PPT精品课程课件讲义
PPT内容可自行编辑
流式细胞仪分析技术及应用
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
PPT内容可自行编辑
开始上课！
流式细胞术
(Flow Cytometry, FCM)
第一节 流式细胞仪的原理
Principle of Flow Cytometer
台式流式细胞仪
台式流式细胞仪
台式流式细胞仪
落地式流式细胞仪
一、工作原理 （一） 液流系统
细胞样品和包裹在外的鞘液，保
证细胞逐个以相同的速度、相同的 轨迹检测区。单细胞流技术。
（二）激发光与光速成形系统
多为氩离子气体激光（488nm）， 用圆柱形透镜聚焦成高15um、宽57um 椭圆形光斑——检测区。长轴垂直细 胞流和激光束中心轴，短轴与细胞轴 一致并重叠。 保证每一细胞受到一致 的光照。单细胞照明技术。
第二节 数据的显示与分析 一、信道值 二、单参数点图及直方图
三、双参数直方图（二维点图）
四、三维图及等高图
谢谢聆听
THANK YOU FOR YOUR ATTENTION
（三）细胞信号检测与分析和处理系统 细胞产生散射光和荧光信号360度发
射。分光镜和滤光片将不同波的光分
开，光电倍增管及电子线路接收并转化
为电信号，模数转化器量化为数字信号
由计算机采集、分析、显示和存储。单
细胞检测技术。
• 二、流式细胞仪检测 • 1.散射光测定 • 2.荧光测定 • 3.细胞分选原理
流式细胞仪分析技术及应用
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
PPT内容可自行编辑
开始上课！
流式细胞术
(Flow Cytometry, FCM)
第一节 流式细胞仪的原理
Principle of Flow Cytometer
台式流式细胞仪
台式流式细胞仪
台式流式细胞仪
落地式流式细胞仪
一、工作原理 （一） 液流系统
细胞样品和包裹在外的鞘液，保
证细胞逐个以相同的速度、相同的 轨迹检测区。单细胞流技术。
（二）激发光与光速成形系统
多为氩离子气体激光（488nm）， 用圆柱形透镜聚焦成高15um、宽57um 椭圆形光斑——检测区。长轴垂直细 胞流和激光束中心轴，短轴与细胞轴 一致并重叠。 保证每一细胞受到一致 的光照。单细胞照明技术。
第二节 数据的显示与分析 一、信道值 二、单参数点图及直方图
三、双参数直方图（二维点图）
四、三维图及等高图
谢谢聆听
THANK YOU FOR YOUR ATTENTION
（三）细胞信号检测与分析和处理系统 细胞产生散射光和荧光信号360度发
射。分光镜和滤光片将不同波的光分
开，光电倍增管及电子线路接收并转化
为电信号，模数转化器量化为数字信号
由计算机采集、分析、显示和存储。单
细胞检测技术。
• 二、流式细胞仪检测 • 1.散射光测定 • 2.荧光测定 • 3.细胞分选原理
流式细胞仪原理ppt课件
300 nm 400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation Emisson
流式细胞仪的组成
仪器硬件组成 计算机硬件系统 软件系统 应用
大型机——FACSVantage SE
多激光多波长 八荧光参数 高速分选 单细胞点对点分选
台式机——FACSCalibur
双激光 488nm 635nm
鞘液、洗液、PMA等：清洁无颗粒杂质
单细胞悬液的处理
荧光标记抗体的染色：使用特异的单克隆抗体
单色分析：直接标记、间接标记 双色分析：SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析：TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT
溶血：FACS Lysing Solution 细胞打孔：FACS Perm2 固定：1%多聚甲醛
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信
号越强
荧光信号
FALS Sensor
Freq
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Fluorescence
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时,
受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物 质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号， 可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析
荧光信号
激发光源与荧光标记物
流式细胞术样本来源
细胞悬液：
分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导 致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差
流式细胞术原理及应用简介PPT课件
淋巴细胞亚群分析实验步骤 Forward Light Detector
照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信 a Cell 响 FL3：>670nm FL4：653-667nm
号的检测和定量就能了解所研究细胞参数 细胞凋亡—Annexin V
分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。
物理方法分离（超声波、筛网等）
荧光信号，称自发荧光。 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。
• 一种是经过特异荧光素标记后，受激发光 可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。
激光光源及光束成形系统
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激 光器。
• 激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚 焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能 量较强，以激发荧光染料。
• 台式机的整个光路是封闭的，在安装时由 工程师调试完毕后，无需用户作任何调节， 使用十分方便。
激光光源及光束成形系统
动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。 • 流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振
动。
流动室与液流驱动系统
FSC及SSC：480-495nm 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT） 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。 FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。 目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 BACKMAN COULTER公司 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 FL3：>670nm FL4：653-667nm AIDS病人T细胞亚群分析 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。 血小板膜糖蛋白分子的表达 FL3：>670nm FL4：653-667nm 细胞凋亡—Annexin V 流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 细胞周期分析——ModiFit 分析 尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。
照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信 a Cell 响 FL3：>670nm FL4：653-667nm
号的检测和定量就能了解所研究细胞参数 细胞凋亡—Annexin V
分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。
物理方法分离（超声波、筛网等）
荧光信号，称自发荧光。 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。
• 一种是经过特异荧光素标记后，受激发光 可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。
激光光源及光束成形系统
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激 光器。
• 激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚 焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能 量较强，以激发荧光染料。
• 台式机的整个光路是封闭的，在安装时由 工程师调试完毕后，无需用户作任何调节， 使用十分方便。
激光光源及光束成形系统
动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。 • 流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振
动。
流动室与液流驱动系统
FSC及SSC：480-495nm 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT） 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。 FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。 目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 BACKMAN COULTER公司 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 FL3：>670nm FL4：653-667nm AIDS病人T细胞亚群分析 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。 血小板膜糖蛋白分子的表达 FL3：>670nm FL4：653-667nm 细胞凋亡—Annexin V 流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 细胞周期分析——ModiFit 分析 尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。
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CD4+ T细胞计数的方法
非FCM 技术
优点
-简单 -低廉
缺点
-低通量 -难于质控
FCM 技术
优点
-自动化方法 -可靠性高(变异系数低) -精密度、准确度和可重复性高 -高通量 -金标准技术
缺点
-设备昂贵 -试剂昂贵 - 需要熟练技术人员操作
仪器的选择
1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞 仪（ FACSCalibur、Coulter)
6
5
4
3
2
1
0
d0
4w
12w
24w
10例患者治疗期间平均VL的变化情况
提示
虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是 单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断检验。其它的 免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:
- 丙球蛋白缺乏症 - 胸腺发育不全 (DiGeorge氏综合症) - 严重的联合免疫缺陷
C D 4 ¸Ï û° ýÊ £¨ ö¸ / u l ©£
VL log copies/ml
350
333
300
309
250
266
200
150
165
100
50
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12w
24w
ÖÎ ÁÆ Ê±¼ä
HAARTÖÎ ÁÆ 6¸ö Ô 10Àý »¼ Õß CD4ϸ °û ƽ ¾ù Êý ±ä »¯
成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，1993年）
临床阶段
CD4+T细胞 A 无症状或急性HIV感 染或持续性全身淋巴结 肿大
B 出现症状， 不是A或C
C 艾滋病指针性症 状
>500/ul （≥29%）
A1
200-499/ul （14-28%）
A2
<200/ul （<14%）
A3
B1
C1
B2
C2
Infection Seroconversion
HAART
CD4 T cell depletion
1000
Death
CD4 T cells/ml
500
200 0 2-6 weeks
Flu-like Disease
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptomatic phase AIDS
功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免 疫荧光染色）
细胞球 Cytosphere （利用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分 离全血中CD4T淋巴细胞
方法 将125ml新鲜血液，放入EDTA管，加350mlPBS，再加 入25ml mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去 掉血液中的单核细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计 分离，并用PBS洗涤2次，加入50ml Lysing溶液，着 色，用epifluorescent显微镜计数。
B3
C3
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎 等）时，就可定义为进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
主要机会性感染的预防
任意值 <200 <100 <75
<50
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性）
CD4绝对计数的原理、方法和 质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
淋巴细胞
B淋巴细胞 CD19+
T淋巴细胞 CD3+
NK细胞 CD3-CD16+56+
T辅助/诱导细胞 CD3+CD4+
T抑制/细胞毒性细胞 CD3+CD8+
淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。 CD4+T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的
2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪 （ FACSCount、Guava)
3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如 Dynabeads） 4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议
用总淋巴细胞来代替。（当总淋巴细胞小于 1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于200 /ul。
非流式细胞技术
<350/mm3
>30000（bDNA）或 >55000(RT-PCR)
建议治疗。另外还要根据 CD4+T细胞下降率和患者的 愿望
无症状期
CD4+T细胞 >350/mm3
<30000（bDNA）或 建议延迟治疗观察。未经治 <55000(RT-PCR) 疗者3年发展至AIDS<15%.
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
价格：3美元/人份
流式细胞术（flow cytometry, FCM）
流式细胞仪
BD-Calibur
BD FACSVantage
对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选
●FCM的特点
保持细胞及细胞器或微粒的结构及功 能不被破坏
从分子水平获取多种信号 对细胞进行定量分析或纯化分选
HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化
CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少 CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒置，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损
外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、 预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方 案以及评价治疗效果的实验室标准指标。
维持具有枢纽的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞 数量的缺失，最终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
MAC CMV（抗体阳性或血培养）隐球菌病
组织胞浆菌病球孢子菌病
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价
病程
CD4+T淋巴细 胞
病毒载量
建议
症状期
任何值
任何值
治疗
无症状期
CD4+T细胞 <200/mm3
任何值
治疗
无症状期
CD4+T细胞 >200/mm3，但