细胞原代培养与传代

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每代贴附生长细胞的生长过程
❖ 游离期 ❖ 贴壁期 ❖ 潜伏期 ❖ 对数生长期 ❖ 停止期（平台期）
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❖ 游离期：
❖ 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此 时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
❖ 10分钟一4小时
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❖ 贴壁期：
❖ 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时 贴壁。
3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、 免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；
4．应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；
缺点：
➢ 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；
➢ 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了， 必然发生变化。
❖ 4 无毒
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常用仪器设备
❖ 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 ❖ CO2培养箱 ❖ 倒置显微镜 ❖ 酶标仪、微孔板震荡器 ❖ 液氮罐 ❖ 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 ❖ 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
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❖ 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广
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细胞系资源
• The American Type Culture Collection (ATCC) • The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) • National Institute of Health (NIH), USA • National Cancer Institute (NCI), USA
（cell line） 从肿瘤组织 培养建立的 细胞群或培 养过程中发 生突变或转 化的细胞， 在培养条件 下可无限繁 殖
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克隆
（clone）亦称无 性繁殖系或无性 系。对细胞来说， 克隆是指由同一 个祖先细胞通过 有丝分裂产生的 遗传性状一致的 细胞群。
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原代培养细胞的生命归宿
❖ 原代培养期 ❖ 传代期 ❖ 衰退期
❖ 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃
❖ 器皿消毒
❖ 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
❖ 酶液等均采用滤过法除菌
❖ 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境
❖ 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料
❖ 培养皿和培养板等表面消毒
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超净台
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❖ 有限细胞系，无限细胞系 ❖ 细胞系 cell line ❖ 细胞株 cell strain
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培养细胞的特性
❖ 培养细胞的生长方式
❖ 贴附生长： ❖ 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 ❖ 悬浮生长： ❖ 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见
于各种造血系统肿瘤细胞
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒
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原代培养与细胞系
原代培养
（primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。
细Байду номын сангаас株
细胞系
（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。
超净工作台的工作 ❖ 原理是利用鼓风机
驱动空气遁过高效 滤器除去空气中的 尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空 气徐徐通过工作台 面，使工作台内构 成无菌环境。
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滤器
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CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：
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细胞培养的基本概念
❖ 传代： ❖ 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到
新的培养器皿中。 ❖ 原代培养 ❖ 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在
传代之前称为原代培养。
❖
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接触抑制（Contact inhibition）
❖ 细胞相互接触时，将停 止增长；
❖ 细胞停留在细胞周期的 G0期；
目录
一． 细胞培养基本概念 二． 细胞培养基本要求 三． 细胞培养基本技术
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细胞培养定义
定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。
优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；
2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控；
❖ 转化的细胞却可以继续 生长导致细胞重叠堆积 生长。
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细胞传代次数（Passage Number）
• 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一 定的界限，称为“ Hayflick极限”。
• 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次； 龟寿命200年，传代140次。
• 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼 年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。
❖ 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。
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❖ 对数生长期：
❖ 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
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❖ 停止期（平台期）：
❖ 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 ❖ 机制：接触抑制、密度依赖性
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二、细胞培养基本要求
❖ 常用仪器设备 ❖ 培养器皿 ❖ 培养基 ❖ 血清 ❖ 其他细胞培养试剂
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培养细胞生长的条件
❖ 1 细胞的营养需要
❖ 2 细胞的生存环境
❖ 温度: 37 ℃
❖ O2
❖ CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
❖ pH: 7.2-7.4
❖ 渗透压
❖ 3 无污染
❖ 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等
❖ 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白 （生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底 物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
❖ 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
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❖ 潜伏期