牛结核病监测和诊断技术研究进展

牛结核病监测和诊断技术研究进展结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriu m)引起的人、畜、禽共患的一种慢性传染病，由人结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、禽型分枝杆菌(M, avium)、非洲分枝杆菌以及田鼠分枝杆菌（M,mi croti）所引起，统称这些病原为结核分枝杆菌复合物(或群)。

目前已知，结核病除感染人外还能使50多种哺乳动物和25种禽类感染，牛是最敏感的动物。

牛结核主要由牛分枝杆菌引起，人结核的10%以上由牛分枝杆菌引起。

每年，世界上大约有3百万人感染牛结核杆菌造成结核病。

中国是世界上感染结核病较高的22个国家之一。

由于牛和人类的关系(牛奶、牛肉及耕牛等)较其他动物更为密切，因此，牛结核又是任何其他动物结核病最大的传染源。

其传染和流行严重地影响到畜牧业的持续健康发展，不仅可以造成奶牛乳房炎、结核性胸膜炎等疾病，还能造成牛奶产乳率和乳质下降，更严重威胁着人类的身心健康。

牛结核病被国际兽疫局定为B类传染病，我国将其列入二类动物疫病。

结核分枝杆菌按其致病力可分为3种型，即人型、牛型和禽型，三者有交*感染现象。

牛型主要侵害牛，其次侵害人、猪、马、绵羊和山羊等，在所有牛种中奶牛最为易感。

牛分枝杆菌共可感染50多种哺乳动物。

本病无季节流行性，一年四季均可发生，在农村主要以散发为主，规模化养牛场主要以区域性流行为主。

牛结核病的潜伏期一般为16～45 d，或者更长，通常为慢性。

在感染初期几乎不表现出特有的临床症状。

感染一段时间后，一般日渐消瘦，精神不振，频频咳嗽，毛粗无光，皮肤失去弹性，食欲不振，产奶量下降等临床症状。

由于牛感染结核病的经过往往比较缓慢，根据动物患病器官的不同，表现出的临床症状也各不一致。

牛结核病的临床症状主要分为以下几种类型：肺结核、乳房结核、肠道结核、淋巴结核和生殖结核等。

目前，在结核病的监测和诊断中，普遍采用结核菌素皮内实验（TT）、细菌痰涂片、细菌的分离培养等传统的技术。

随着科学技术的进步免疫学和分子生物学技术有了很大的发展，出现了很多适合结核病检测的先进技术，本文就对这些新老技术进行简要的概述。

一、检测诊断技术的概述（一）细菌学检测技术1.结核杆菌的生物学特征。

结核杆菌大小为0.2～0.5 μm×1.5～4.0 μm，两端钝圆，无芽胞和荚膜，无鞭毛，不运动，革兰氏染色呈阳性。

人型结核杆菌细长而稍弯曲，牛型略短而粗，禽型小而粗，而且略具多形性。

本菌由于细胞壁中含有大量的糖脂，普通的染色方法很难使其着染。

通常采用萋尔-尼尔逊抗酸染色法进行染色，抗酸杆菌呈特征性的红色，而其它细菌和细胞呈蓝色。

2.结核杆菌的培养特性。

通常采集患病动物的尿液、痰、胸水、腹水、脓液或伤口分泌物和肺、淋巴结等有典型钙化灶的病变器官进行细菌的分离培养。

本菌为专性需氧菌，对营养要求严格，常用罗杰二氏培养基、改良的罗杰二氏培养基、丙酮酸培养基和小川培养基培养。

最适生长温度为37℃～37.5℃。

本菌生长缓慢，特别是初代培养，一般需10-30d才能看到菌落。

其生长速度依次为禽分支杆菌，结核分支杆菌，牛分支杆菌。

菌落粗糙、隆起、不透明、边缘不整齐，呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色。

在液体培养基里，因菌体含类脂而具疏水性，形成浮于液面有皱褶的菌膜。

传统的结核杆菌临床诊断一般依赖于细菌学方法，其中痰涂片抗酸染色法快速，但灵敏度低，特异性差，需要观察者有丰富的经验积累，且至少需要有大于5×106/L的细菌才能检测到阳性结果，而且无法区分MTB和非MTB感染，同时不能区分死菌和活菌。

此方法培养时间较长(至少2个月)，已很难满足生产与生活的需要。

但是不论是何种检测技术最终的完全确诊还要以罗杰(L-J)固体培养法为金标准。

（二）免疫学检测技术结核分支杆菌是细胞内寄生菌，因此机体抵抗结核分支杆菌的感染主要依靠细胞免疫。

在机体感染了结核分支杆菌后，最早在机体内引起的是细胞免疫；而体液免疫是随着感染时间的延长而缓慢的增强；细胞免疫在结核杆菌感染的后期又不表现出来，所以要准确的判断动物所处的感染期，以采用合适的检测方法。

1.结核菌素皮内试验（TT）。

用各种提纯的结核菌素（PP D）皮内注射动物，一段时间后根据皮厚差来判断结核病的一种方法。

目前该方法被世界各国广泛采用，并且是世界动物卫生组织OIE推荐的诊断牛结核病的唯一方法。

该方法检出率和准确性都比较高，但用该方法不能区分致病性分支杆菌和非致病性分支杆菌感染，更不能区分致病性结核杆菌的型、在用BCG免疫的地区或国家，不能区分自然感染和免疫个体、对感染严重的个体有可能出现假阴性的结果、在一段时间内（30d），由于迟发性变态反应（DTH）不能重复进行、必须进行严格的质量控制，否则严重影响结果。

同时此技术操作要求较高，主观性比较大，不能进行大规模的流行病学调查。

2.间接ELISA法（iELISA）。

根据抗原在固体支持物上的吸附性及抗原抗体的特异性与酶的高效性的原理而设计的方法。

该方法简单易行，无需特殊精密仪器；能够大规模的进行流行病学调查，且具有高特异性高敏感性的特点，所以在结核病血清学诊断方面研究最多，目前该方法主要作为PPD的一个补充。

但该方法由于观察对象不同、检测使用抗原不同、质量控制困难等影响了该实验的结果，导致其结果差异较大。

早期采用PPD作为检测抗原，随着分子生物学和基因工程技术的发展，大量的蛋白在体外获得并用于诊断抗原的研究。

该方法较PPD-ELISA具有更高的特异性，但敏感性有所下降。

据报告ELISA法检测结核抗体的敏感性为62.0％～94.7％，特异性为91.2％～94.0％。

因此，目前此法仍不失为结核病、特别是肺外结核诊断中有价值的实验室诊断方法之一。

3.免疫斑点测定法。

即以硝酸纤维膜代替免疫滴定板，以特异的结核菌抗原致敏结合在纤维膜带上，再与检测血清反应，继之以酶标记的抗牛IgG偶联反应后进行显色反应，用肉眼或光密度计与标准斑点比较，此法更易施行。

有人认为可作为初筛试验。

目前已有商品采用胶体金与蛋白质A结合物代替酶与第二抗体偶联，可在数分钟至20 min内完成。

4.免疫印迹法。

是利用SDS-P A GE技术与酶的高敏感性相结合的技术。

首先用SDS-P A GE把蛋白按分子量分开，再把分开的蛋白转移到硝酸纤维膜上，用检测血清来进行中和反应。

继之以酶标记的抗牛IgG偶联物，再加底物显色，观察结果进行分析。

此法过于复杂，但有助于新抗原的鉴定的研究。

陆学东等以此技术检测496例结核病，610例正常人的及非结核病病人的血清，其敏感性90%，特异性96%。

优于同时进行的ELISA法。

作者还发现30～43KDa多肽成分是主要的诊断抗原成分。

5.淋巴细胞增生实验。

致敏的外周血淋巴细胞（PBLC）在特异性抗原的刺激下，可使抗原特异性T淋巴细胞亚群发生增生性反应。

然后用同位素或5-溴脱氧尿苷标记，配合流式细胞仪，可对其进行识别和计数。

通过测定外周血循环中的增生淋巴细胞的比例可了解淋巴细胞增生的程度，间接反映淋巴细胞被特异性抗原致敏的情况，从而分析动物机体对结核杆菌的细胞免疫状态。

该方法试验耗时而且前期准备以及试验操作都比较复杂，比如需要较长的孵育期和要使用放射性核苷酸，所以在常规的牛结核病诊断中并不被采用，而仅仅用于野生动物以及动物园动物的检测。

6. IFN-γ检测法。

IFN-γ又称Ⅱ型干扰素，是一种由C D4+TH1、CD8+T型细胞以及NK细胞产生的细胞因子，它不仅具有Ⅰ型IF N(α-干扰素、β-干扰素)的抗病毒和抗肿瘤活性，更重要的是还具有促进MHCⅡ类抗原表达、增强A PC细胞与T细胞的相互作用、增强T细胞辅助抗体产生和细胞毒性T细胞产生的能力等诸多免疫调节活性。

其原理是当从感染牛获得的致敏淋巴细胞再次遇到牛提纯结核菌素(主要是MTB特异性的蛋白抗原(如ESAT-6、CFP-10) )，可以在体外模拟延迟型过敏反应(D TH)，从而使得致敏淋巴细胞释放相对大剂量的γ干扰素。

而γ干扰素可以用IF N-γ的免疫学检测方法检测到，没有感染的牛，其淋巴细胞再次遇到抗原时，并不释放γ干扰素。

因此，检测到γ干扰素与牛型结核分枝杆菌的接触具有相关性。

检测方法是将试验牛的血液淋巴细胞培育，加入特异性的抗原一起孵育16～24 h，致敏的淋巴细胞释放出IF N-γ，以IFN-γ-ELISA 进行定量测定。

体外IFN-γ释放反应除特异性较高外，还有以下一些优点，结果较为客观，24～48 h可完成，不会激发记忆性免疫反应。

但其最大的缺点是价格昂贵，因而短时间内较难普遍推广。

γ-干扰素测定法的广泛性田间试验己在世界上许多国家(包括澳大利亚、爱尔兰、新西兰、阿根廷、西班牙、意大利和美国)完成，并在澳大利亚和新西兰被认可为正式试验。

目前已有20多万头经过测试，本法敏感性为77％～93.6%，而相对于PPD试验的敏感性为65.6％～84.4%，特异性为98.1％。

（三）分子生物学检测技术1.结核杆菌的基因组特征。

牛分支杆菌AF2122/97基因序列全长4,345,492 bp，其中GC 含量为65.63％，含有3952个编码蛋白的基因，一个噬菌体和42个插入元件。

其基因组在核酸水平上与人型结核分支杆菌有大于99.95％的同源性，二者之间表现出明显的线性相关,但并未表现出广泛的易位、重复或翻转。

在牛结核分支杆菌基因组中有11处基因缺失，大小范围为1～12.7 kb。

研究发现，人型复合分枝杆菌(包括人结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲型分枝杆菌以及田鼠分枝杆菌)中存在一些插入序列(IS)可作为探针用于结核病的诊断,同时采用限制性酶切片段长度多态性(RFLP)技术对人型复合分枝杆菌能进行种水平的鉴定分型研究。

研究最广泛的是与肠杆科中插入片段相类似的插入基因片段,包括IS6110,IS986和IS987。

这些基因片段都只存在于人型复合分枝杆菌中, 并以多拷贝形式出现。

近年发现人型复合分枝杆菌中还含有第二类插入序列IS1081, 它与IS6110极为不同, 但与金黄色葡萄球菌中IS256相似。

IS1081也只存在于人型复合分枝杆菌中,拷贝数为6个。

2.用于结核病检测的主要分子生物学技术。

用于结核病的诊断技术主要有核酸扩增技术、基因探针技术、PCR与基因探针相结合的技术、DNA指纹图谱检测法、基因测序法和生物芯片技术等。

(1)核酸扩增技术。

PCR是一种根据核酸复制原理采用分子技术模拟细胞内核酸复制过程的DNA或RN A体外扩增技术。

1989年,Hance等最先报道将PCR技术应用于结核分枝杆菌（TB）的检测。

PCR检测方法的突出特点是灵敏度高,可以检测出1～100fg纯化的分枝杆菌D NA, 相当于1～20个MTB, 与传统的痰涂片抗酸染色和MTB培养方法相比,其敏感性得到了大大提高。