γ-干扰素释放法检测奶牛结核病的比较试验(1)

2013年第10期畜牧兽医科技信息社,1979：20-64.

[2]李璞.黑龙江省的淡水螺类采集报告[J].哈尔滨医科大学学报,

1956（3）:41-52.

[3]齐钟彦,等.中国动物图谱—软体动物第四册[M].北京:科学出版

社.1985：4-23.

[4]刘月英.白洋淀及其附近地区的淡水螺类[J].动物学报,1961,13

（1-4）:123-132.

[5]刘月英，等.淡水螺类与人们的关系[J].动物学杂志,1977,3:46-48.

[6]周贵,等.东毕血吸虫中间宿主—淡水螺的研究[J].吉林农业大学

学报,1996,18（1）:59-63.

[7]唐崇惕,等.内蒙古科尔沁草原绵羊不同虫龄土耳其斯坦东毕吸

虫及虫卵孵化的实验观察[J].动物学报,1990,36（4）:366-375.

[8]唐崇惕,等.内蒙科尔沁草原淡水螺吸虫幼虫期的调查研究[J].动

物学报,1986,32（4）:335-341.

牛结核病（bovine tuberculosis）是由牛型分枝杆菌等所

引起的一种人兽共患的慢性消耗性传染病，被国际动物卫生

组织OIE列为需通报的动物疫病。目前，我国主要采用牛型

提纯结核菌素（PPD）进行单纯颈部皮试变态反应（SCT）来进

行牛结核病的检疫，对于阳性牛应进行隔离或扑杀，但是许

多被扑杀的牛并没有区分可能检疫方法照成的假阳性或，这

对于牛结核病的检疫，奶牛业的发展造成了巨大的阻力。掌

握我市奶牛结核病现状、检测淘汰感染奶牛意义重要。因此

采用灵敏度更高、特异性更好的检测方法具有广泛应用价

值。为此，本研究旨在γ-干扰素释放试验（IGRA）的应用优

势，通过比较单纯颈部皮试变态反应（SCT）、比较皮试变态反

应（CCT）和γ-干扰素释放试验（IGRA）之间的效果，为临床

实际应用提供依据。

1材料与方法

皮肤试验用牛型PPD、禽型PPD为中

国兽医监察所购买。BOVIGAM’试剂盒购自瑞士Prionics公

司。

我市春季奶牛两病监测中单纯牛型PPD初

筛为结核病阳性或疑似阳性的奶牛，共计89头。其中粗筛判

为阳性的74头，可疑的15头。

奶牛尾静脉无菌采血5mL／头，

将采集的血液置于肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒混匀，使肝素

钠溶解。室温下将血样运送到实验室，在采血后8h内进行刺

激培养。将全血样品无菌分装至24孔板中，每份血样分装3

孔，1.5mL／孔。向各孔中分别无菌加入100μL PBS、A-

VianPPD、Bovine PPD，震荡混匀1min。将含有血液与抗原的

24孔板置于37℃湿温培养箱中孵育24h。次日从各培养孔

吸取500μL血浆上清转入1.5mL离心管中，即为刺激产生

的γ-干扰素上清。以Prionics公司购得的试剂盒检测牛全

血上清液中的γ-干扰素，具体操作参照试剂盒说明书进

行。结果判定标准：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激

上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的0D值-禽型

PPD刺激上清的0D值≥0.1判为阳性；牛型PPD刺激上清

的OD值-PBS刺激上清的OD值<0.1或牛型PPD刺激上

清的0D值-禽型PPD刺激上清的0D值<0.1，则判为阴性。

试验参照国家标准《动物结γ-干扰素释放法检测

奶牛结核病的比较试验

毛爱民1，倪谷音2，范锋1

（1.江苏省无锡市动物疫病预防控制中心；2.无锡市动物园管理处，无锡214000）

摘要：目的评价r干扰素释放试验（IGRA）牛结核病检疫过程中的效果。在牛结核病检疫过程中对皮试初筛为结核病和疑似结核病的89（74/15）头奶牛同时进行γ-干扰素试验、单纯颈部皮试变态反应（SCT）和比较皮试变态反应（CCT）检测，结果单纯颈部皮试变态反应二次检疫中89头牛均判为阳性，单纯颈部皮试变态反应与比较皮试变态反应的阳性符合数为67头。阳性符合率为75.3%；γ-干扰素释放试验和单纯颈部皮试变态反应检测两者的阳性符合数为64头，阳性符合率为71.9%；γ-干扰素释放试验与比较皮试变态反应的阳性符合数为58头，阳性符合率为

79.5%。阴性符合数为16头，阴性符合率为48.4%。结论γ-干扰素释放试验在保持较高灵敏度的同时，具有比变态

反应更好的特异性。

关键词：牛结核；r干扰素试验；单纯颈部皮试变态反应；比较皮试变态反应

DOI:10．3969/J.ISSN．1671-6027．2013．10.013

试验研究

30

2013年第10期畜牧兽医科技信息

核病诊断技术（GB／T18645—2002）》进行，仅采用牛型PPD

在奶牛颈部进行皮试变态反应，剂量为2000U（IU）／头，分

别于注射前和注射后72h测量皮肤厚度，并计算出皮厚差，

依据国家标准判断结果，对粗筛和二次复核均为可疑的判为

阳性。

试验参照OIE《动物疫苗和诊断手册》

中牛结核病诊断方法进行，该方法在欧盟（EU）国家广泛使

用，并以议会指令64／432／EEC推荐。在牛颈部同时分点注

射牛型和禽型PPD，使用剂量均为2000IU／头，禽型PPD注

射位点在牛型PPD下方间隔约10～15cm处。分别于注射前

和注射后72h测量牛型PPD和禽型PPD注射处的皮肤厚

度，并计算出各自的皮厚差。如果牛型PPD的皮厚差大于禽

型PPD的皮厚差且超过4mm判为阳性，1～4mm为可疑，小

于或等于禽型PPD的皮厚差为阴性。

2结果

SCT、CCT、IGRA三种方法对89头牛的检疫结果为：

SCT检出阳性89头，检出率（复核判定）100%，CCT检出阳

性67头，检出率（与SCT符合率）75.3%，IGRA检出阳性64

头，检出率（与SCT符合率）71.9%。（表1）

CCT、IGRA二种方法对检出的阳性牛的结果差异为：共

同检出为阳性的58头，阳性符合率79.5%，共同检出阴性的

16头，阴性符合率48.4%，检出结果有差异的15头，其中

CCT阳性而IGRA阴性的9头，IGRA阳性而CCT阴性的6

头。（表2）

表2CCT、IGRA二种方法对检出的阳性牛的结果比较

3分析和讨论

牛结核病的诊断方法主

要有病原学诊断和免疫学诊断。病原学诊断包括传统的细菌

学检测和分子生物学诊断技术。但目前分子生物学诊断技术

（PCR诊断）敏感性较差，细菌学检测则需要采集死亡家畜的

病料来检测,因此病原学诊断不适合大规模的活畜检疫。牛结

核病的免疫学检测方法包括血清学检测和细胞免疫检测，一

般认为分枝杆菌引起的机体免疫应答以细胞免疫为主，因此

检测特异性抗体的EILSA方法应用价值受限。目前在我国牛

结核病检疫过程中，主要采用SCT，但该方法存在较多的假

阳性。另外，该方法具有操作过程困难。试验所需时间较长、

受外界干扰因素较多、结果判定主观性较强等一系列缺点。

在本实验过程中，我们将SCT、CCT、IGRA进行了比较分析。

结果显示虽SCT具有较高的检出率，但其特异性不好。

该方法的基本原理同

结核菌素皮内变态反应。但整个操作过程在体外进行。牛型、

禽型PPD同时刺激可以有效区分牛分枝杆菌感染和环境中

的禽分枝杆菌的干扰。该方法克服了皮试变态反应的技术

性、主观性以及环境分枝杆菌的干扰问题，同时还可以同其

他疾病的检测相结合，尤其是奶牛两病普查时可以进行一次

采血后可以同时进行牛结核病和布鲁氏菌病的检测，既节省

了人力物力和时间，又可以减少对奶牛的刺激，防止造成产

奶量的下降。

IGRA已被OIE认可，可作为牛结核病的辅助

确诊试验，并在欧盟、美国、澳大利亚和新西等被批准为正式

试验。以IGRA作为结果判定标准，可排除25头牛感染牛结

核病，削减损失。实验结果显示，SCT虽具有较好的敏感性，

阳性检出率明显高于IGRA，但与IGRA相比。特异性较低，

可能的主要原因之一是SCT检出的阳性牛中，有相当一部分

是由禽结核感染照成的干扰，通过CCT法也可证实这一特

点。IGRA法敏感性和特异性与OIE《动物疫苗和诊断手册》

在欧盟（EU）国家广泛使用CCT法对比，本实验显示者的差

异性不大，可推荐使用，切前者保持较高灵敏度的同时，具有

后者更好的特异性。

参考文献

[1]world organization for Animal Health[OIE]．Manual of diagnostic

tests and vaccines for terrestrial animals[M]．Pa ris，Bovine

tuberculosis．2009，16-22．

[2]张高迪.等.内蒙古哲里木盟人与牛结核相互传播关系的研究[J].

内蒙古畜牧兽医，1996，47-49．

[3]张喜悦，等.发达国家牛结核的防控措施及对我国的启示[J].中国

人兽共患病学报，2009，25（5）：473-476．

[4]wood PR，et al．Bovigam：an in vilro cellular diagnostic testfor

bovine tuberculosis[J].Tuberculosis（Edinb）.2001,81（1-2）：147-155．

[5]杨卫冲，等.牛结核病诊断技术的研究进展[J].中国人兽共患病学

报，2004，20（12）：1090-1093．

[6]蒋柏茂，等.奶牛结核病实验室诊断技术研究进展[J].中国奶牛，

2009，4：38-39．

[7]张喜悦，等.γ-干扰素试验及比较皮试在结核污染牛群的应用

研究[J].中国人兽共患病学报,2010.26（1）：53-56．

[8]wood PR，et at．Development of a3imple，rapidro cellular assay

for bovine tuberculosis based on theproduction of gamma inter

feron[J].Res Vet Sci，1990，49（1）：46-49．

[9]Gonzalez oR，et at．Field evaJuatjonof the single intradermal

cervical tuberculin testind the interfere-on-γassay for

detection and eradication of bovine tuberculosis in Spain[J].Vet

Microbiol，1999，70：55-66．

[10]张成全，等.重组γ干扰素单克隆抗体的研究[J].中国动物传染

病学报，2009，17（4）：15-19．

[11]陈样，等.γ-干扰素ELISA检测方法的建立与初步应用[J].中

国动物传染病学报，2010，18（4）：54-59．表1SCT、CCT、IGRA三种牛结核病检疫方法的比较

试验研究

31