干扰素释放试验检测方法培训课件
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干扰素释放试验(共28张PPT)
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
30
IGRAs的结核特异免疫抗原
• SAT-6和CFP一10主要存在于MTB复合群，而在卡介苗和大多数 NTM中缺失，因此IGRAs的特异度较好。
• 但ESAT-6和CFP—10也存在于少数几种NTM中，如堪萨斯分枝杆
菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、转黄分枝杆菌和胃分枝杆，
IGRAs可发挥其辅助作用
• 应用于活动性结核病的辅助诊断
• 应用于LTBI诊断中
IGRAs用于体液或组织标本？
近几年来国内有IGRAs(仅限于ELISPOT方法)辅助诊断结核性胸膜 炎和结核性腹膜炎等肺外结核的报道，其中采用胸腔积液和 腹水等体液或组织标本检测的IGRAs的敏感度和特异度高达
90％以上，采用血液标本检测时IGRAs则并未显示出优势。 此类研究报道数量不多，病例数也不足，
筛查LTBI。
• 除HIV感染者外，类风湿关节炎等自身免疫性疾病、器官移植等免疫功能受 损患者及糖尿病等特殊患者，因其自身原因，或接受糖皮质激素或肿瘤坏死 因子 TNF拮抗剂等免疫抑制药物治疗导致免疫功能缺陷，这类患者是LTBI发 展为结核病的高风险人群，对这类患者也有必要进行LTBI筛查。
应行IGRAs和PPD检测的6种情况（WHO 2015）
阳性者进一步采用IGRAs帮助确认；
(2)不宜采用IGRAs对大范围人群进行LTBI筛查；
(3)PPD试验仍是在健康人群中动态筛查LTBI的首选。
• (1)对HIV感染人群进行LTBI筛查，单用PPD试验的敏感度不高，
应单用IGRAs或联合使用PPD试验，在方法选择上优先考虑细胞
检测技术。
• (2)自身免疫性疾病和器官移植患者在接受糖皮质激素或 TNF-拮抗剂治疗前，应单用IGRAs或联合使用PPD试验
γ-干扰素体外释放试验45页文档
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
γ-干扰素体外释放试验
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
谢谢你的阅读
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
γ-干扰素体外释放试验
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
谢谢你的阅读
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、
r干扰素释放试验检测方法培训PPT精选文档
AID
20
T-SPOT.TB 结果判读
A B C D
< 10 斑点相减
> 20
通常正常结果，空白对照孔没有或很少斑点（<10个），阳性质控对照孔斑点数 >20个。
21
T-SPOT.TB 结果判读
N孔斑点数 >10 ≤5
6≤N≤10
P孔斑点数 任何值 ≥20 ≤19 ≥20 ≤19
T孔-N孔斑点数 任何值
(刺激所有T细胞都能释放r-干扰素)
6
IGRA中特异结核抗原
结核杆菌RD区特异抗原：
• ESAT-6: Rv3875编码 结核分枝杆菌早期分泌抗原
• CFP-10: Rv3874 编码 结核分枝杆菌培养滤过蛋白10
Rv3874 (CFP-10) Rv3875 (ESAT-6)
Rv3871～Rv3879
8
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用）
1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌
双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌）
细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液
台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。
16
第五步：铺板
可拆卸板（按样本数取出相应条数） 避免交叉污染、混匀细胞悬液
25万个细胞/孔 （100ul）
细胞培养箱（37度） 16-20h（过夜）
45度角 缓慢加入淋巴细胞分离液
细胞-干扰素(医学PPT课件)
*
目前，在中草药中发现广泛存在半抗原，如小檗碱、茶碱、丹参酮等，具有生化活性基因的化学成分都有可能成为半抗原，这些半抗原可与体内蛋白质结合成完全抗原，造成一些过敏反应。
*
抗原的特异性既表现在免疫原性上，也表现在反应原性上。
沙门氏杆菌
大肠杆菌
抗大肠杆菌的抗体
抗沙门氏杆菌的抗体
结合
结合
抗体 是对其抗原有极强专一性 的 魔弹 或 巡弋飞弹
IFN作用特点:
产生的时间早； 中断受染细胞的病毒感染，限制病毒扩散； IFN诱导的抗病毒蛋白，只对病毒起作用， 不影响宿主细胞蛋白质合成。
专题二 抗体制药
第一节 概述 第二节 单克隆抗体 第三节 基因工程抗体 第四节 噬菌体抗体工程 第五节 抗体诊断试剂和抗体药物
四 干扰素抗病毒机理
干扰素具有广谱抗病毒作用，又具有细胞种属特征。即某一种动物产生的干扰素只能保护同种属或近缘种属动物细胞。 干扰素是一种活性很强的生物制剂，既能治疗病毒性疾病，又具有抗肿瘤和调节免疫机能的作用。
四 干扰素抗病毒机理
干扰素抗病毒作用
作用机理 不是直接杀灭病毒
IFN → 抗病毒蛋白基因 → 抗病毒蛋白 (蛋白激酶, 磷酸二脂酶)
Each hybridoma line can produce pure single antibody, called mon
oclonal antibody.
If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be culture
d and produce antibody.
单克隆抗体的应用
*
基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。 1984年：人-鼠嵌合抗体 1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。 已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/80~1/3，而且消除了鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。
目前，在中草药中发现广泛存在半抗原，如小檗碱、茶碱、丹参酮等，具有生化活性基因的化学成分都有可能成为半抗原，这些半抗原可与体内蛋白质结合成完全抗原，造成一些过敏反应。
*
抗原的特异性既表现在免疫原性上，也表现在反应原性上。
沙门氏杆菌
大肠杆菌
抗大肠杆菌的抗体
抗沙门氏杆菌的抗体
结合
结合
抗体 是对其抗原有极强专一性 的 魔弹 或 巡弋飞弹
IFN作用特点:
产生的时间早； 中断受染细胞的病毒感染，限制病毒扩散； IFN诱导的抗病毒蛋白，只对病毒起作用， 不影响宿主细胞蛋白质合成。
专题二 抗体制药
第一节 概述 第二节 单克隆抗体 第三节 基因工程抗体 第四节 噬菌体抗体工程 第五节 抗体诊断试剂和抗体药物
四 干扰素抗病毒机理
干扰素具有广谱抗病毒作用，又具有细胞种属特征。即某一种动物产生的干扰素只能保护同种属或近缘种属动物细胞。 干扰素是一种活性很强的生物制剂，既能治疗病毒性疾病，又具有抗肿瘤和调节免疫机能的作用。
四 干扰素抗病毒机理
干扰素抗病毒作用
作用机理 不是直接杀灭病毒
IFN → 抗病毒蛋白基因 → 抗病毒蛋白 (蛋白激酶, 磷酸二脂酶)
Each hybridoma line can produce pure single antibody, called mon
oclonal antibody.
If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be culture
d and produce antibody.
单克隆抗体的应用
*
基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。 1984年：人-鼠嵌合抗体 1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。 已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/80~1/3，而且消除了鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。
内分泌干扰素PPT课件
1.2 体外实验 这一类实验的设计是基于大部分环境内分泌干 扰物质在体内的作用机制,即在体内与17β -雌二 醇竞争结合雌激素受体体外实验主要有以下几 种 (1)细胞培养 (2)受体竞争性结合测定 (3)分子生物学检测技术 美国环境学家将与雌激素受体结合机制进一 步延伸,研究出与之对应的基于雄激素受体结合 的检测方法作为基于雌激素受体结合的检测方 法的补充。通过对环境内分泌干扰物质的雌激 素样活性
及对雄激素的抑制活性两个方面来综合考虑 环境内分泌干扰物质对内分泌系统的毒性。 但目前的生物检测方法的结果都只能说明环境 内分泌干扰物质的整体效应,而不能对受试物中 环境内分泌干扰物质的组成详加分析,并且一些 方法要求的技术条件较高,时间较长,费用也很高。 显然建立一种方便、准确、快捷且费用低的检 测方法是当务之急。
社会现象
人们接触较多的是含 有雌激素的日用品，包括 各种消毒剂、洗涤剂、化 妆品、稀释剂、塑料制品、 金属( 铅、汞和砷等)、杀虫 剂、电子产品中的电路板、 化工产品( 含甲基苯、苯胺、 酚、烷基类、硝基类化合物)。
环境内分泌干扰物通过 某些途径，如污染水源、食 物或经皮肤吸收进入机体后 可以干扰内分泌激素的合成 释放、转运、与受体结合、 代谢等途径，从而影响内分 泌系统功能，破坏机体内环 境的协调和稳定。
2.物理检测技术
一般使用色谱仪器分析化 学合成品,如液相色谱和气相 色谱分析。色谱分析技术对 样品的前处理过程要求非常 高,需要从复杂的基质样品中 将低浓度的目标化合物高效 提取、纯化和浓缩。随着色 谱技术与质谱技术的结合,检 测分析的选择性和灵敏度得 到很大提高,检测范围有所扩 大。
一般来说,色谱分析的前处理的萃取只能 提取一类或几类物理性质相似的环境内分泌干扰 物质,因此要完全分析样品,必须采用不同的萃取、 纯化方法分别提取与分析,这样耗时较长,费用也 较大。国内的姚文,栾和林采用GC-MS检测样品 中的烷基酚,在20min左右的进样时间内分别在 酮肟与醛肟萃取液中检测出几十种壬基酚的同 分异构体。
医学检验·检查项目：干扰素_课件模板
医学检验·各论 干扰素
内容课件模板
医学检验·各论：干扰素 >>>
简介：
干扰素(interferon，IFN)分为两型， Ⅰ型干扰索包括α-IFN和β-IFN是由白细 胞和成纤维细胞产生，Ⅱ型干扰素，又称 γ-IFN或免疫干扰素是由有丝分裂原刺激 T淋巴细胞产生。干扰素是一种高效的抗 病毒生物活性物质，又是一种具有广泛免 疫调节作用的淋巴因子。干扰素检测方法
医学检验·各论：干扰素 >>>
简介： 较多，如空斑减少法ห้องสมุดไป่ตู้病毒定量法、放免 测定法与细胞病变抑制法等。
医学检验·各论：干扰素 >>>
临床意义： 降低：慢性支气管哮喘。
医学检验·各论：干扰素 >>>
正常值： 细胞微量抑制法：2～6KU/L。
医学检验·各论：干扰素 >>>
相关症状： 发热伴寒战、乏力、食欲不振、右上腹痛。
医学检验·各论：干扰素 >>>
相关疾病： 小肠腺癌、风疹、直肠癌、病毒性肺炎、 病毒性咽炎、病毒性心肌炎、人类T淋巴 细胞病毒感染、大肠癌、结肠癌、胃癌。
谢谢！
内容课件模板
医学检验·各论：干扰素 >>>
简介：
干扰素(interferon，IFN)分为两型， Ⅰ型干扰索包括α-IFN和β-IFN是由白细 胞和成纤维细胞产生，Ⅱ型干扰素，又称 γ-IFN或免疫干扰素是由有丝分裂原刺激 T淋巴细胞产生。干扰素是一种高效的抗 病毒生物活性物质，又是一种具有广泛免 疫调节作用的淋巴因子。干扰素检测方法
医学检验·各论：干扰素 >>>
简介： 较多，如空斑减少法ห้องสมุดไป่ตู้病毒定量法、放免 测定法与细胞病变抑制法等。
医学检验·各论：干扰素 >>>
临床意义： 降低：慢性支气管哮喘。
医学检验·各论：干扰素 >>>
正常值： 细胞微量抑制法：2～6KU/L。
医学检验·各论：干扰素 >>>
相关症状： 发热伴寒战、乏力、食欲不振、右上腹痛。
医学检验·各论：干扰素 >>>
相关疾病： 小肠腺癌、风疹、直肠癌、病毒性肺炎、 病毒性咽炎、病毒性心肌炎、人类T淋巴 细胞病毒感染、大肠癌、结肠癌、胃癌。
谢谢！
γ干扰素释放试验在结核感染临床诊断中的应用ppt课件
• T-SPOT.TB的斑点数虽然不能精确地与结核活动程度呈正相关, 但仍然存在着结核活动程度越高斑点数越多的趋势。
• T-SPOT.TB 阳性人群, 定期复查监测斑点数变化很有必要。如 果T-SPOT.TB 斑点数在短时间内显著增加, 则强烈提示体内结 核活动, 给予预防性治疗十分必要 。
·
18
潜伏病人的筛查
·
12
实验结果判断----无反应性
• 不符合“有反应性”条件，属于“无反 应”。即视为阴性。
·
13
实验结果判断----假阴性
• 当阳性对照组结果为“不确定”(＜20个)，且 抗原A和B孔均”无反应“时，试验结果判断 为”不确定“。
·
14
敏感性与特异性评价
• 由于潜伏性结核感染的诊断无金标准, T-SPOT.TB 敏感性评价仅在 培养或病理阳性的活动性结核患者中进行。
•敏感性优于结核菌素试验，且不受卡介苗 接种的影响 •较少受到其他分支杆菌的影响 •阴性意义大于阳性，排除诊断更佳。
·
19
治疗效果评价
• 体内的效应T细胞，随着结核菌的清除 而消失 • 可作为评估结核菌清除的指标之一
·
20
实验结果判断注意事项
1. 非黄金标准 2. 定性而非定量检测 3. 敏感性和特异性均优于既往手段，但仍然存在一定假阳性率 4. 不能准确评判结核病是否活动 5. 四岁以下儿童的敏感性不优于结核菌素试验，不推荐使用 6. 在结核性胸膜炎中敏感性（62～75%）优于ADA和结核抗体；
• 国内研究数据显示敏感度和特异度差别较大，敏感 性53~98％，特异性60％～90％，但多数文献报 道的敏感度和特异度>70％，优于PPD试验。
• 考虑到我国肺结核患者中，菌阴者所占比例较高， 在这类患者缺乏细菌学依据时，斑点试验能够给病 人的诊断提供帮助。
• T-SPOT.TB 阳性人群, 定期复查监测斑点数变化很有必要。如 果T-SPOT.TB 斑点数在短时间内显著增加, 则强烈提示体内结 核活动, 给予预防性治疗十分必要 。
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潜伏病人的筛查
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实验结果判断----无反应性
• 不符合“有反应性”条件，属于“无反 应”。即视为阴性。
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实验结果判断----假阴性
• 当阳性对照组结果为“不确定”(＜20个)，且 抗原A和B孔均”无反应“时，试验结果判断 为”不确定“。
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敏感性与特异性评价
• 由于潜伏性结核感染的诊断无金标准, T-SPOT.TB 敏感性评价仅在 培养或病理阳性的活动性结核患者中进行。
•敏感性优于结核菌素试验，且不受卡介苗 接种的影响 •较少受到其他分支杆菌的影响 •阴性意义大于阳性，排除诊断更佳。
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19
治疗效果评价
• 体内的效应T细胞，随着结核菌的清除 而消失 • 可作为评估结核菌清除的指标之一
·
20
实验结果判断注意事项
1. 非黄金标准 2. 定性而非定量检测 3. 敏感性和特异性均优于既往手段，但仍然存在一定假阳性率 4. 不能准确评判结核病是否活动 5. 四岁以下儿童的敏感性不优于结核菌素试验，不推荐使用 6. 在结核性胸膜炎中敏感性（62～75%）优于ADA和结核抗体；
• 国内研究数据显示敏感度和特异度差别较大，敏感 性53~98％，特异性60％～90％，但多数文献报 道的敏感度和特异度>70％，优于PPD试验。
• 考虑到我国肺结核患者中，菌阴者所占比例较高， 在这类患者缺乏细菌学依据时，斑点试验能够给病 人的诊断提供帮助。
干扰素体外释放试验共41页文档
干扰素体外释放试验
•
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
•
27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
•
28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
•
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
•
30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
•
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
•
27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
•
28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
•
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
•
30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
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γ-干扰素释放试验（IGRAs）
两种IGRAs用于商业诊断： T-SPOT®.TB (ELISPOT-based IGRA) QuantiFERON®-TB Gold (ELISA-based IGRA)
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
γ-干扰素释放试验（IGRAs）
第四步：计数细胞
• 计算公式：
需要的细胞悬液量(ml)=每个培养孔需要加入细胞数量 /(100,000)×需要使用 的细胞稀释液量 (ml)/ 计数的每ml细胞数量 (106 / ml)。
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。
结核分枝杆菌基因组
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
T-SPOT.TB检测试剂、组份
T-SPOT.TB检测试剂盒
无血清培养液AIM-V（分装使用） 可拆卸96孔板（8连条） 组 份 特异抗原A和B（ESAT-6和CFP-10） 阳性抗原PHA 抗体、显色液
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
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T-SPOT.TB操作流程
Procedures:
6ml
Ficoll
250,000 cells/well
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第一步：采血
推荐使用： 肝素/肝素钠/肝素锂抗凝管 (提问: 4ML采血管可行吗?回答:更改为6ML)
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用）
1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌
双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌）
细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液
台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
所有试剂使用前提前1-2h平衡至室温（抗原可适当减少平衡时间）
• 结核杆菌感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞。 • 当效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会大量分泌IFN-γ
• 直接检测IFN-γ 或者检测分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞可用于 诊断是否有结核杆菌感染。（隐性感染即存在活菌/存在效应 T淋巴细胞）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• ESAT-6: Rv3875编码 结核分枝杆菌早期分泌抗原
• CFP-10: Rv3874 编码 结核分枝杆菌培养滤过蛋白10
Rv3874 (CFP-10) Rv3875 (ESAT-6)
Rv3871～Rv3879
试剂盒中结核抗原： ESAT-6和CFP-10的重叠肽段
RD-1 (M.TB毒力区)
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第五步：铺板
可拆卸板（按样本数取出相应条数） 避免交叉污染、混匀细胞悬液
25万个细胞/孔 （100ul）
细胞培养箱（37度） 16-20h（过夜）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
500ulAIM-V 培养基重悬
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第四步：计数细胞
血球计数板人工计数
细胞计数仪计数
每ml细胞数量= 细胞计数× 稀释倍数×104
调整PBMCs浓度：2.5*106cell/ml 需要500ul（100ul*4孔）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
样本采集后4小时内分离外周血单个核细胞， 室温放置，请勿置于冷冻或冷藏室。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第一步：采血
<2 儿童 2-9岁儿童 成人或>10儿童 免疫低下/受抑制成人
2ml静脉血 4ml静脉血 6ml静脉血 8ml静脉血
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
➢ TB抗原孔(A): ESAT-6 (panel A) ➢ TB 抗原孔(B): CFP-10 (panel B) ➢ 阳性对照孔(P): 植物凝集素抗原(PHA)
(刺激所有T细胞都能释放r-干扰素)
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
IGRA中特异结核抗原
结核杆菌RD区特异抗原：
第二步：单个核细胞（PBMC）分离
按照血液：Ficoll淋巴分离液=2～3:1 轻缓加于Ficoll淋巴分离液上 层，注意不能够将血样与分离液混合。室温下（18-25℃），1000 RCF(g) 离心22分钟。
45度角 缓慢加入淋巴细胞分离液
1000g，22min 务必缓降
中间白膜层
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
培训内容
1 T-SPOT.TB 技术原理 2 T-SPOT.TB 检测试剂、组份 3 T-SPOT.TB技术操作流程（SOP） 4 T-SPOT.TB操作常见问题
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第三步：收集PBMC
吸取中间白膜层并转移至无菌15ml尖底离心管，生理盐水和RPMI1640培 养基各洗涤细胞1次，弃上层液，加入0.5ml AIM-V培养基重悬细胞。取适量 混匀的细胞悬液适当稀释后进行细胞计数。
生理盐水洗涤1次(也可用1640)， 18℃，600g，7min RPMI1640培养基洗涤1次 18℃，350g，7min
T-SPOT.TB 技术原理
+ 抗原
基于ELISPOT技术，计数分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞数目
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
T-SPOT.TB
• 基于外周血单个核细胞（PBMC）的ELISPOT 技术， 敏感性更高。
• 每例样本同时检测4个孔： ➢ 阴性对照孔(N): 无任何抗原刺激
两种IGRAs用于商业诊断： T-SPOT®.TB (ELISPOT-based IGRA) QuantiFERON®-TB Gold (ELISA-based IGRA)
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γ-干扰素释放试验（IGRAs）
第四步：计数细胞
• 计算公式：
需要的细胞悬液量(ml)=每个培养孔需要加入细胞数量 /(100,000)×需要使用 的细胞稀释液量 (ml)/ 计数的每ml细胞数量 (106 / ml)。
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。
结核分枝杆菌基因组
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T-SPOT.TB检测试剂、组份
T-SPOT.TB检测试剂盒
无血清培养液AIM-V（分装使用） 可拆卸96孔板（8连条） 组 份 特异抗原A和B（ESAT-6和CFP-10） 阳性抗原PHA 抗体、显色液
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T-SPOT.TB操作流程
Procedures:
6ml
Ficoll
250,000 cells/well
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第一步：采血
推荐使用： 肝素/肝素钠/肝素锂抗凝管 (提问: 4ML采血管可行吗?回答:更改为6ML)
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用）
1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌
双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌）
细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液
台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
所有试剂使用前提前1-2h平衡至室温（抗原可适当减少平衡时间）
• 结核杆菌感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞。 • 当效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会大量分泌IFN-γ
• 直接检测IFN-γ 或者检测分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞可用于 诊断是否有结核杆菌感染。（隐性感染即存在活菌/存在效应 T淋巴细胞）
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• ESAT-6: Rv3875编码 结核分枝杆菌早期分泌抗原
• CFP-10: Rv3874 编码 结核分枝杆菌培养滤过蛋白10
Rv3874 (CFP-10) Rv3875 (ESAT-6)
Rv3871～Rv3879
试剂盒中结核抗原： ESAT-6和CFP-10的重叠肽段
RD-1 (M.TB毒力区)
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第五步：铺板
可拆卸板（按样本数取出相应条数） 避免交叉污染、混匀细胞悬液
25万个细胞/孔 （100ul）
细胞培养箱（37度） 16-20h（过夜）
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500ulAIM-V 培养基重悬
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第四步：计数细胞
血球计数板人工计数
细胞计数仪计数
每ml细胞数量= 细胞计数× 稀释倍数×104
调整PBMCs浓度：2.5*106cell/ml 需要500ul（100ul*4孔）
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样本采集后4小时内分离外周血单个核细胞， 室温放置，请勿置于冷冻或冷藏室。
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第一步：采血
<2 儿童 2-9岁儿童 成人或>10儿童 免疫低下/受抑制成人
2ml静脉血 4ml静脉血 6ml静脉血 8ml静脉血
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➢ TB抗原孔(A): ESAT-6 (panel A) ➢ TB 抗原孔(B): CFP-10 (panel B) ➢ 阳性对照孔(P): 植物凝集素抗原(PHA)
(刺激所有T细胞都能释放r-干扰素)
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IGRA中特异结核抗原
结核杆菌RD区特异抗原：
第二步：单个核细胞（PBMC）分离
按照血液：Ficoll淋巴分离液=2～3:1 轻缓加于Ficoll淋巴分离液上 层，注意不能够将血样与分离液混合。室温下（18-25℃），1000 RCF(g) 离心22分钟。
45度角 缓慢加入淋巴细胞分离液
1000g，22min 务必缓降
中间白膜层
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培训内容
1 T-SPOT.TB 技术原理 2 T-SPOT.TB 检测试剂、组份 3 T-SPOT.TB技术操作流程（SOP） 4 T-SPOT.TB操作常见问题
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第三步：收集PBMC
吸取中间白膜层并转移至无菌15ml尖底离心管，生理盐水和RPMI1640培 养基各洗涤细胞1次，弃上层液，加入0.5ml AIM-V培养基重悬细胞。取适量 混匀的细胞悬液适当稀释后进行细胞计数。
生理盐水洗涤1次(也可用1640)， 18℃，600g，7min RPMI1640培养基洗涤1次 18℃，350g，7min
T-SPOT.TB 技术原理
+ 抗原
基于ELISPOT技术，计数分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞数目
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T-SPOT.TB
• 基于外周血单个核细胞（PBMC）的ELISPOT 技术， 敏感性更高。
• 每例样本同时检测4个孔： ➢ 阴性对照孔(N): 无任何抗原刺激