干扰素释放试验检测方法培训课件
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文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
培训内容
1 T-SPOT.TB 技术原理 2 T-SPOT.TB 检测试剂、组份 3 T-SPOT.TB技术操作流程（SOP） 4 T-SPOT.TB操作常见问题
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第三步：收集PBMC
吸取中间白膜层并转移至无菌15ml尖底离心管，生理盐水和RPMI1640培 养基各洗涤细胞1次，弃上层液，加入0.5ml AIM-V培养基重悬细胞。取适量 混匀的细胞悬液适当稀释后进行细胞计数。
生理盐水洗涤1次(也可用1640)， 18℃，600g，7min RPMI1640培养基洗涤1次 18℃，350g，7min
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第五步：铺板
可拆卸板（按样本数取出相应条数） 避免交叉污染、混匀细胞悬液
25万个细胞/孔 （100ul）
细胞培养箱（37度） 16-20h（过夜）
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T-SPOT.TB操作流程
Procedures:
6ml
Ficoll
250,000 cells/well
Байду номын сангаас
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第一步：采血
推荐使用： 肝素/肝素钠/肝素锂抗凝管 (提问: 4ML采血管可行吗?回答:更改为6ML)
样本采集后4小时内分离外周血单个核细胞， 室温放置，请勿置于冷冻或冷藏室。
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第一步：采血
<2 儿童 2-9岁儿童 成年人或>10儿童 免疫低下/受抑制成人
2ml静脉血 4ml静脉血 6ml静脉血 8ml静脉血
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T-SPOT.TB 技术原理
+ 抗原
基于ELISPOT技术，计数分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞数目
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T-SPOT.TB
• 基于外周血单个核细胞（PBMC）的ELISPOT 技术， 敏感性更高。
• 每例样本同时检测4个孔： ➢ 阴性对照孔(N): 无任何抗原刺激
• 结核杆菌感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞。 • 当效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会大量分泌IFN-γ
• 直接检测IFN-γ 或者检测分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞可用于 诊断是否有结核杆菌感染。（隐性感染即存在活菌/存在效应 T淋巴细胞）
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第二步：单个核细胞（PBMC）分离
按照血液：Ficoll淋巴分离液=2～3:1 轻缓加于Ficoll淋巴分离液上 层，注意不能够将血样与分离液混合。室温下（18-25℃），1000 RCF(g) 离心22分钟。
45度角 缓慢加入淋巴细胞分离液
1000g，22min 务必缓降
中间白膜层
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• ESAT-6: Rv3875编码 结核分枝杆菌早期分泌抗原
• CFP-10: Rv3874 编码 结核分枝杆菌培养滤过蛋白10
Rv3874 (CFP-10) Rv3875 (ESAT-6)
Rv3871～Rv3879
试剂盒中结核抗原： ESAT-6和CFP-10的重叠肽段
RD-1 (M.TB毒力区)
➢ TB抗原孔(A): ESAT-6 (panel A) ➢ TB 抗原孔(B): CFP-10 (panel B) ➢ 阳性对照孔(P): 植物凝集素抗原(PHA)
(刺激所有T细胞都能释放r-干扰素)
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IGRA中特异结核抗原
结核杆菌RD区特异抗原：
结核分枝杆菌基因组
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T-SPOT.TB检测试剂、组份
T-SPOT.TB检测试剂盒
无血清培养液AIM-V（分装使用） 可拆卸96孔板（8连条） 组 份 特异抗原A和B（ESAT-6和CFP-10） 阳性抗原PHA 抗体、显色液
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γ-干扰素释放试验（IGRAs）
两种IGRAs用于商业诊断： T-SPOT®.TB (ELISPOT-based IGRA) QuantiFERON®-TB Gold (ELISA-based IGRA)
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γ-干扰素释放试验（IGRAs）
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用）
1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌
双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌）
细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液
台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
所有试剂使用前提前1-2h平衡至室温（抗原可适当减少平衡时间）
500ulAIM-V 培养基重悬
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第四步：计数细胞
血球计数板人工计数
细胞计数仪计数
每ml细胞数量= 细胞计数× 稀释倍数×104
调整PBMCs浓度：2.5*106cell/ml 需要500ul（100ul*4孔）
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第四步：计数细胞
• 计算公式：
需要的细胞悬液量(ml)=每个培养孔需要加入细胞数量 /(100,000)×需要使用 的细胞稀释液量 (ml)/ 计数的每ml细胞数量 (106 / ml)。
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。
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1 T-SPOT.TB 技术原理 2 T-SPOT.TB 检测试剂、组份 3 T-SPOT.TB技术操作流程（SOP） 4 T-SPOT.TB操作常见问题
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第三步：收集PBMC
吸取中间白膜层并转移至无菌15ml尖底离心管，生理盐水和RPMI1640培 养基各洗涤细胞1次，弃上层液，加入0.5ml AIM-V培养基重悬细胞。取适量 混匀的细胞悬液适当稀释后进行细胞计数。
生理盐水洗涤1次(也可用1640)， 18℃，600g，7min RPMI1640培养基洗涤1次 18℃，350g，7min
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第五步：铺板
可拆卸板（按样本数取出相应条数） 避免交叉污染、混匀细胞悬液
25万个细胞/孔 （100ul）
细胞培养箱（37度） 16-20h（过夜）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
T-SPOT.TB操作流程
Procedures:
6ml
Ficoll
250,000 cells/well
Байду номын сангаас
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第一步：采血
推荐使用： 肝素/肝素钠/肝素锂抗凝管 (提问: 4ML采血管可行吗?回答:更改为6ML)
样本采集后4小时内分离外周血单个核细胞， 室温放置，请勿置于冷冻或冷藏室。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第一步：采血
<2 儿童 2-9岁儿童 成年人或>10儿童 免疫低下/受抑制成人
2ml静脉血 4ml静脉血 6ml静脉血 8ml静脉血
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T-SPOT.TB 技术原理
+ 抗原
基于ELISPOT技术，计数分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞数目
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
T-SPOT.TB
• 基于外周血单个核细胞（PBMC）的ELISPOT 技术， 敏感性更高。
• 每例样本同时检测4个孔： ➢ 阴性对照孔(N): 无任何抗原刺激
• 结核杆菌感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞。 • 当效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会大量分泌IFN-γ
• 直接检测IFN-γ 或者检测分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞可用于 诊断是否有结核杆菌感染。（隐性感染即存在活菌/存在效应 T淋巴细胞）
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第二步：单个核细胞（PBMC）分离
按照血液：Ficoll淋巴分离液=2～3:1 轻缓加于Ficoll淋巴分离液上 层，注意不能够将血样与分离液混合。室温下（18-25℃），1000 RCF(g) 离心22分钟。
45度角 缓慢加入淋巴细胞分离液
1000g，22min 务必缓降
中间白膜层
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• ESAT-6: Rv3875编码 结核分枝杆菌早期分泌抗原
• CFP-10: Rv3874 编码 结核分枝杆菌培养滤过蛋白10
Rv3874 (CFP-10) Rv3875 (ESAT-6)
Rv3871～Rv3879
试剂盒中结核抗原： ESAT-6和CFP-10的重叠肽段
RD-1 (M.TB毒力区)
➢ TB抗原孔(A): ESAT-6 (panel A) ➢ TB 抗原孔(B): CFP-10 (panel B) ➢ 阳性对照孔(P): 植物凝集素抗原(PHA)
(刺激所有T细胞都能释放r-干扰素)
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
IGRA中特异结核抗原
结核杆菌RD区特异抗原：
结核分枝杆菌基因组
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
T-SPOT.TB检测试剂、组份
T-SPOT.TB检测试剂盒
无血清培养液AIM-V（分装使用） 可拆卸96孔板（8连条） 组 份 特异抗原A和B（ESAT-6和CFP-10） 阳性抗原PHA 抗体、显色液
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
γ-干扰素释放试验（IGRAs）
两种IGRAs用于商业诊断： T-SPOT®.TB (ELISPOT-based IGRA) QuantiFERON®-TB Gold (ELISA-based IGRA)
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γ-干扰素释放试验（IGRAs）
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用）
1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌
双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌）
细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液
台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
所有试剂使用前提前1-2h平衡至室温（抗原可适当减少平衡时间）
500ulAIM-V 培养基重悬
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第四步：计数细胞
血球计数板人工计数
细胞计数仪计数
每ml细胞数量= 细胞计数× 稀释倍数×104
调整PBMCs浓度：2.5*106cell/ml 需要500ul（100ul*4孔）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
第四步：计数细胞
• 计算公式：
需要的细胞悬液量(ml)=每个培养孔需要加入细胞数量 /(100,000)×需要使用 的细胞稀释液量 (ml)/ 计数的每ml细胞数量 (106 / ml)。
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。