体内药物分析-生物样品与样品制备(2)

唾液中；S/P很大表示药物的离子化程度很低
8
组织
（1）匀浆化法：组织→加入水或缓冲液→匀浆→上清液 （2）沉淀蛋白法：组织→加入蛋白沉淀剂→上清液 （3）水解：组织→加入酸或碱→加热使组织液化→上清
液 （4）酶水解：组织→加入酶和缓冲液→加热使组织液化
→上清液
9
头发
优点：取样方便、无损伤性、检样的掺伪的可能性 低、能对某些特定的代谢物进行测定、能了解数 月至数年用药的情况、可用于体内微量元素含量 测定、可用于临床用药、滥用药物和毒性药物的 检测
缺点：样品的预处理繁琐、干扰多、药物的含量低 、需要精密仪器
10
特点： 广谱性 积累性 稳定性 依时性 相关性 指纹性
一般在枕部采取样本，国外一般 在靠近头皮处剪取，分别于6～10 处取10个样本，从根部剪断，超 过12cm的均按照12cm处剪断
11
头发洗涤
1、丙酮－水－丙酮
2、丙酮预洗→洗洁精洗涤 头 发 3、洗衣粉浸泡 的 预 4、二氯甲烷 洗
第三章 生物样品与样品制备
1
【大纲要求】
1、掌握生物样品的种类及其特点 2、掌握生物样品的各种预处理方法的原
理及其应用
2
第一节 生物样品的种类、采集、 制备与贮存
3
一、种类、采集和制备
(一) 血液(Whole blood, Plasma, Serum) 1、血样采集 2、血样制备 不能作为作用部位药物浓度的可靠指标 血浆的制备 血液→含有抗凝剂的试管→混合→ 2500r／min
完，不能反复冷冻→解冻→冷冻(FTC)；样品应以小 体积分装存放。
14
第二节 生物样品的预处理与制备
15
一、预处理目的
（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度 （二）纯化、富集药物 （三）适应和满足测定方法要求的灵敏度 （四）防止对分析仪器的污染和劣化
16
二、样品制备时应考虑的问题
（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围 （二）药物测定的目的 （三）生物样品种类和杂质干扰类型 （四）样品的化学组成 （五）药物的蛋白结合率 （六）被测组分在预处理过程中的稳定性 （七）样品在收集、储存等过程中容器的污染 （八）样品的预处理过程要求简便 （九）预处理的最后一步应富集被测组分 （十）对分析方法的要求
26
1、液－液提取法（LLE） 大多数药物都是脂溶性的，内源性物质 基本上都是水溶性的，当用有机溶剂萃取 时，药物被萃取出来而内源性物质被除去 ，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化 的目的。
17
18
三、样品的预处理技术
（一）经有机破坏的方法
1、湿法破坏
2、干法破坏
硝酸－高氯酸法
高温电阻炉灰化法
电热消化器法
低温等离子灰化法
电热板消化法
烘箱消化法
3、氧瓶燃烧法
19
（二） 去除蛋白质
1、溶剂Fra Baidu bibliotek法
常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）： 乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、 丙酮、四氢呋喃 体积比：1：1～3 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
2、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清 液冻存或直接分析。
3、优点：（1）非损伤性取样，（2）可用于药代动力学研究， （3）不受采血时间和地点限制，（4）样品易收集，病人易接 受
4、应用：（1）在TDM中的应用
根据S/P分类，S/P＜1.0表示药物在唾液中的浓度很低；S/P
＝1.0表示适合药物的监测；S/P不固定表示药物显著转移到了
6
(二) 尿液
1、尿药测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清 除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、 预测药物的代谢过程和代谢类型
2、尿的采集：非损伤性采样方式、药物浓度较高 、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影 响。
3、尿样的保存与处理：
7
(三)唾液
1、唾液的采集：漱口后15min进行，采集时间为10min，采用 一些物理或化学方法刺激唾液分泌；（1）缩短采样时间，（2 ）减小唾液pH变化范围，（3）刺激后得到的唾液其唾液－血 浆分布比例的个体差异较小。
～3000r／min离心5min →上清液即为血浆。 血清的制备 血样→室温放置30min到1h →出现血饼→剥去血
饼→以2000r/min～3000r/min离心5min～ 10min →分取上清液即为血清
当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品 4
肝素的加入： 1ml血液/需要肝素0.1～0.2mg，通常不需 准确加入，在取血前可取少量肝素钠溶液（ 1～2滴）置于试管内，旋转试管，使肝素溶 液均匀分布于试管壁上，干燥后加入血样后 立即轻轻振摇即可。
5、SDS洗涤
6、甲醇
都需要反复清 洗2～3次
12
毛发样品的制备
1、直接甲醇提取 2、酸水解 3、碱水解 4、酶水解 5、超临界流体萃取 6、有机破坏
13
二、生物样品的贮存与处理
（一）冷藏或冷冻 1、血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃，
长期-20℃ 2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存 3、唾液：在4℃下保存，往往需要在取样时测定pH值 4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测
5
全血：血液置于抗凝管中，不经离心操作，冷冻储存 或直接分析 需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度 如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制 血浆药物浓度很低凝影响测定
血样的特点： 缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦 优点：可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药
物监测 大多数测定的时原型药物总量
体积比：1：0.6 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
23
24
其他去除蛋白的一些方法 1、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 2、超滤法 3、酶水解法 4、加热法
25
（三） 分离、纯化与浓集
1、液－液提取法（LLE） 2、固相萃取（SPE） 3、自动化SPE技术 4、固相微萃取（SPME） 5、膜萃取（ME） 6、微透析技术（MD） 7、超临界流体萃取（SFE）
20
21
（二） 去除蛋白质
2、加入中性盐
常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白 脱水而沉淀）：
饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸 橼酸盐
比例：1：2 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
22
（二） 去除蛋白质
3、加入强酸
常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）： 10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液 、5％偏磷酸