霍乱弧菌食品中毒案例

一起O139群霍乱弧菌引起的食源性疾病暴发疫情分析
【案例】事件概况：2012年7月，在甲、乙、丙三个市陆续出现剧烈腹泻和呕吐病例，腹泻粪便为水样便、患者无腹痛、里急后重和发热症状；首例患者出现在甲市，经省、市疾病预防控制中心联合处置，判定为一起由来自丙市农贸市场甲鱼污染O139群霍乱弧菌引起的食源性疾病暴发疫情。

事件经过：7月某日，乙市村民张XX家举办寿宴，来自甲、乙、丙市的亲朋好友参加。

宴请食物中有用从乙市农贸市场购买并来自丙市农贸市场的甲鱼加工的菜品，第二天甲市朱XX发病，并出现上述症状，疾控中心接报后进行处置，最终确认了本起疫情。

【讨论题】请复述省市疾控中心从接到第一例患者发病报告后开始进行的诊断处理过程（不包括对疫情的控制措施），并简述如何确认致病病原和污染食品来源的方法和步骤。

【参考答案】
省市疾控中心从接到第一例患者发病报告后首先对病人采取紧急处理，采取病人标本，以备送检；对病人的急救治疗；其次对中毒食品的控制：保护现场，封存中毒食品或疑似中毒食品；追回已售出的中毒食品或疑似中毒食品；最后对中毒场所采取消毒处理。

当甲、乙、丙三个市陆续出现类似症状的腹泻病例时，CDC需要调查病例之间有无流行病学联系，并考虑是否存在其他病例没有就诊以及没有被发现。

同时立即调集流行病学、食品卫生学、微生物检验、理化检验等学科专业人员前往现场调查。

开展调查的主要工作流程和工作内容如下图：
一、现场流行病学调查：调查应包括流行病调查和卫生学调查
CDC在暴发疫情调查处理过程中要进行主动搜索，及时发现感染者。

首先要核实诊断，对病例和带菌者进行详细的个案调查，将获得得临床表现、流行病学史、病原学检测等信息填入个案调查表，并对密切接触者进行调查，要求进行详细的饮食史、接触史、活动史，注意不能仅询问是否饮用生水、食用生菜，而且要将有关可疑饮食种类、食用地点、购买地点等涉及污染来源追踪所需信息，均进行详细询问和记录。

找出传染来源、传播因素，评价扩散危险程度，并采集腹泻患者标本、相关食品标本、环境标本（水体、家居环境）等。

1、个案调查：询问患者共同食物接触史，接触时间，了解中毒发生的时间、经过、中毒人数及严重程度，初步确定可疑餐次和食品。

询问患者72小时内吃过哪些食物，进食量、进食时间、地点、烹饪方式、购买食品地点。

调查宴席中患者吃过的哪些食物，统计患者共同吃过的食物，调查发现患者均接触过甲鱼做的那道菜及其他几个菜，而未发病的人吃了其他几个菜没有发病，所以高度怀疑污染源是甲鱼。

（需要患者仔细回忆，尽可能减少偏倚）
2、病因假设与验证：基于调查获得得已知事实、数据和信息，进行病因假设的推断。

验证病因假设的调查应根据前期调查信息和实验室诊断可利用程度确定。

根据实验室诊断和流行病学调查可推断发病病因是患者均吃过甲鱼那道菜，所以致病病原和污染食品来源是甲鱼。

3、危险因素调查：根据病因假设提出或通过分析流行病学获知的危险因素，组织开展实验室验证，查明污染，以获得支撑流行病学调查的重要实验证据。

主要类型包括水污染调查、食品因素调查和环境因素调查等。

（1）水污染状况调查：患者饮用水源、厨房用水及直接关联的水体。

（2）食品相关因素调查：
A、烹饪过程的污染调查：通过仔细询问了解可疑食品从采购到餐桌的全过程、厨房卫生状况（包括储存方法、餐厨具清洁方法、食品加工工具如砧板、刀具、碗碟等）、厕所卫生状况及污水管理情况。

B、食品加工人员的健康调查：询问相关人员是否有健康证，近期手上有无创口以及最近的健康状况
C、水产品污染调查：如甲鱼
（3）环境因素调查：患者居住环境，饮用水类型等
二、实验室检测分析
实验室检测流程图
1、样品采集
（1）采集急性期患者粪便、呕吐物、洗胃水、尿液、血液及肛拭子，采集后尽快送检。

A、粪便：尽可能在使用抗生素前采集患者自然排出的新鲜水样便，约5mL。

B、呕吐物和洗胃水：用无菌压舌板或棉拭子挑取少量呕吐物作为检材，放
入自封塑料袋中并封好袋口或置于灭菌带盖瓶中，然后盖紧瓶盖，立即置于冷藏箱中。

洗胃水置于灭菌容器内冷藏送检。

C、血液：采血前要核对病人姓名、年龄、性别、编号及检验项目等，按试验项目要求，准备好相应的容器，如空白试管、抗凝管或促凝管等。

病人应取坐
位或卧位，采血部位通常是前臂肘窝的正中静脉。

按静脉穿刺法抽取所需血量。

采血后，取下针头，将血液顺管壁缓缓注入已选择好的标本瓶。

D、肛拭法：先用无菌甘油水或生理盐水湿润棉签，多余的液体紧靠管壁挤出；再用棉拭或肛门采便管由肛门插入直肠内约3cm-5cm处，轻轻旋转360°，擦取直肠表面黏液后取出。

避免采便量过少。

E、尿液：随机尿。

（2）、采集甲鱼加工人员和厨房人员肛拭子、创口样品、宴席剩余食物、烹饪过程用过的厨房用具、未经烹饪的的食材、调味品、末梢水、加工用具、宰前甲鱼、宰后甲鱼、鱼的食饵等标本进行检测。

采集标本时注意事项：
①针对不同的可疑食品，采集整体或部分标本，带至实验室。

注意采集过程中不同食品不能交叉污染。

②物体表面：用灭菌棉拭蘸以灭菌生理盐水涂擦与甲鱼相关物体表面，放入到装有少量生理盐水的采样管中，立即冷藏。

③甲鱼：选取海水产品或涂抹拭子置于塑料袋内，尽快送往实验室。

如在一箱甲鱼中可采取数只甲鱼的体表作为一个标本送检，这比只做一只甲鱼体内检查其阳性检出机会可能更多。

3、血液常规检查：主要观察红细胞、白细胞血象改变。

同时可观察血清钾、钠、氯化物、PH等数量变化。

4、尿液常规检：主要观察尿液是否有蛋白质、红细胞、白细胞及管型。

5、快速诊断：
（1）动力试验：用接种环或滴管取1滴水样便在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力。

如在镜下见到鱼群穿梭样运动（像夜空中的流星）即动力试验阳性，否则阴性。

（2）涂片染色：取粪便或早期培养物涂片作革兰染色镜检。

如镜检为革兰阴性稍弯曲的弧菌，且动力试验为阳性，可初步报告为霍乱弧菌引起的暴发疫情。

根据血象和粪便常规检查结果，可推断是细菌性食物中毒。

6、病原菌检查
（1）常规镜检（包括性状、颜色）粪便可见黏液和少许红、白细胞。

（2）悬滴检查将新鲜粪便作悬滴或暗视野显微镜检，可见运动活泼呈穿梭状的弧菌。

（3）制动试验取急性期病人的水样粪便或碱性胨水增菌培养6小时左右的表层生长物，先作暗视野显微镜检，观察动力。

如有穿梭样运动物时，则加入01群多价血清一滴，若是01群霍乱弧菌，由于抗原抗体作用，则凝集成块，弧菌运动即停止。

如加01群血清后，不能制止运动，应再用0139血清重作试
验。

（4）增菌：将患者或者其他食品、水体、物品涂抹等标本在选择性培养基上进行直接培养、或经过增菌后再做培养。

粪便、呕吐物等标本可直接进行分离培养或增菌后培养，水和食品等标本需进行过滤、沉淀、剪碎、稀释等处理，然后进行增菌和分离培养。

粪便留取应在使用抗菌药物之前，且应尽快送到实验室作培养。

增菌培养基一般用pH8.4的碱性蛋白胨水，36～37℃培养6～8小时后表面能形成菌膜。

此时应进一步作分离培养，并进行动力观察和制动试验，这将有助于提高检出率和早期诊断。

（5）分离培养常用庆大霉素琼脂平皿或碱性琼脂平板。

前者为强选择性培养基，36～37℃培养8～10小时霍乱弧菌即可长成小菌落。

后者则需培养10～20小时。

（6）血清鉴定：选择可疑或典型菌落，与O139群抗血清、O1群多价和单价做玻片凝集反应，若在血清中很快出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性，反之阴性。

（7）生化鉴定：氧化酶试验和粘丝试验
按以上流程同时做了沙门、空肠弯曲菌、产毒性大肠杆菌等其他可引起腹泻性食物中毒的可疑菌种，但是均未出现与霍乱弧菌相同的实验现象，可以排除其他菌的可能。

7、常规PCR检测霍乱毒素基因：
i.引物：可使用引物对5’-ATT TTG AGG TGC TCC ATG TG-3’和5’-ATA AAG CAG
TCA GGT GGT CT-3’
ii.PCR扩增反应体系：在0.5mL微量离心管中按顺序加入以下各种成分：纯水、缓冲液、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA
iii.扩增参数：94℃预变性5min，94℃30sec，56℃，40sec，72℃，1min，30个循环；最后72℃延伸7min。

iv.PCR扩增结束后，在样本管中加入溴酚蓝样液，通过琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后通过紫外灯观察结果，根据扩增产物的有无和片段大小判断。

8、噬菌体分型（双层琼脂平皿法）：五株分型噬菌体主要来自患者和水体，用于增菌的菌株。

A、操作：取培养物200μL加至已溶化并冷却至50℃的半固体琼脂中，混乱后均匀倾注于固体琼脂平皿上，凝固后，分别滴加5μL噬菌体及菌株。

B、结果判定：出现全裂解、几乎裂解、半全裂解、不透明裂解、弱裂解或不同数量的噬斑者均为阳性，可疑裂解与不裂解者为阴性。