实验主要仪器及方法
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DAB显色试剂盒包括：A：DAB显色剂（20*）
B：缓冲液（20*）
C：底物H2O2（20*）
在显色前30分钟，按顺序取每种试剂各一滴（50ul）加入850ul蒸馏水中，配成即用型的DAB显色剂。
主要试剂配制：
4%甲醛固定液：40%甲醛1份
蒸馏水9份
伊红水溶液：伊红0.5克
蒸馏水100毫升
氯化钙0.5克
乙醇、70%乙醇、蒸馏水各2min,PBS(PH7.4)3min*3次
(3)热修复:浸于柠檬酸盐缓冲液中,微波,中高火7min,凉至室温。PBS缓冲液洗5min
*3次。
(4)灭活内源性酶:每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断剂(试剂A),室温下孵育
约10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次,每次5min。
f、80%酒精5分钟
g、70%酒精5分钟
h、流水冲洗5分钟
（2）、染色：
a、苏木素染色，一般以稍深染为宜5分钟
b、流水冲洗，洗去苏木素和浮色5分钟
c、1%盐酸酒精，分化几秒至30秒，使切片褪色至淡蓝红色即可
d、流水冲洗，洗涤30～60分钟，使组织呈鲜蓝色或天蓝色
e、伊红染色1分钟
f、流水冲洗10分钟，洗去伊红浮液，并用纱布擦净玻片上多余的染料
(5)4℃、10000rPm离心15min。样品分为三层:上层为无色水相和一个中间层,底层为黄
色有机相,RNA主要在水相中,小心取上清,转至新的Ep管。
(6)用等体积异丙醇沉淀水相中的RNA。混匀后室温孵育10min,4℃、12000rPm条件下离
心10min,弃上清液。
(7)75%乙醇(DEPC水处理)洗涤沉淀一次(至少lm175%乙醇/mlTRIZOL),4℃、7500rpm,
0.1%DEPC溶液:新鲜烧制的三蒸水500ml，加入DEPC溶液0.5ml，胶塞封口后用力震荡使DEPC溶液充分混匀溶解，37℃放置过夜，在15psi条件下高压灭菌20分钟，使残余的DEPC失活。
75%酒精配制（0.1%DEPC处理）：取75ml无水乙醇与25ml三蒸水混合即可，每次使用前新鲜配制，置于-20℃预冷。
取5u1RNA,在1%琼脂糖凝胶上电泳,质量好的RNA电泳后可见2~3条带,分别为28S、18S和5SRNA,无拖尾现象,表明抽提的总RNA是完整的。
用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIZOL体积10%。充分碾磨,直至无明显可见
的颗粒。碾磨过程中,注意冰上操作。
(2)将匀浆样品室温(15一30℃)放置5min,使核酸蛋白复合物分离。
(3)4℃、12000rpm条件下离心20min后,取上清,转至新的Ep管中。
(4)每使用lmlTRIZOL加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15Sec,使之充分混匀后室温放置3min
实验主要仪器：
石蜡切片机
光学显微镜及成像系统
解剖显微镜
正立荧光显微镜
血糖仪及血糖试纸
XYJ-1烤片机
普通家用冰箱
超低温冰箱
恒温水浴箱
隔水式电热恒温培养箱
自动旋转式混匀仪
电热恒温鼓风干燥箱
高温高压蒸汽消毒锅
分析电子天平
微波炉
数字式酸度计
磁力搅拌机
SW-CJ-2F型双面超净工作台
Shandon Histocentre 3型脱水包埋机
1%盐酸乙醇溶液：浓盐酸1ml
80%乙醇99ml
2%戊巴比妥溶液：戊巴比妥2克
蒸馏水100ml
3%甲醇-H2O2溶液：30%H2O2 1份
甲醇9份
PBS缓冲液（PH=7.2~7.6）氯化钠8.5克
磷酸氢二钠2.8克
磷酸二氢钠0.4克
蒸馏水1000ml
PBST溶液：PBS溶液中加入TWEEN-20，按照1000:1的比例配制而成。TWEEN是一种离子表面活性剂，它可加速抗体非特异性结合的分离，PBST较PBS可将多余的抗体洗脱的更为彻底，背景更为清晰。
5)溶液:全部采用新鲜三蒸水配制,并按照0.1%的比例加入DEPC水处理过夜,121℃高压灭菌20min后储存备用。
总RNA的提取
实验全程中注意冰上操作,离心机提前预冷,操作者应在无菌工作台工作,避免RNA分解酶的污染。
采用TRIZOL试剂提取心脏组织总RNA,具体步骤如下:
(1)匀浆处理:将心脏组织在己充分预冷的匀浆器中磨碎,每50一100mg组织加入lmlTRIZOL,
免疫组化检测
(l)载玻片处理(多聚一L一赖氨酸法):
将充分洗净、干燥的载玻片浸泡于500ug/ml的多聚一L一赖氨酸(wt.>l50,000)溶液内数十秒或提拉十次,然后取出,于室温下放置12~24小时自然晾干,或在45℃以下烤箱内烘干,处理后的玻片保存于避光干燥的条件下可长期使用"
(2)脱蜡:二甲苯(I)(11)各15min脱蜡,无水乙醇(I)(11)各5min,95%乙醇、80%
（3）、脱水：
a、吸去玻片上的水分后移入80%酒精中脱水，约1～2分钟
b、移入90%酒精中脱水约2～4分钟
c、移入无水酒精中彻底脱水，约4～8分钟
（4）、透明：
a、移入二甲苯Ⅰ中透明3～5分钟。
b、移入二甲苯Ⅱ中透明5～10分钟。
（5）、封固：
用中性树胶封固。先从二甲苯Ⅱ中取出切片，将组织外围的二甲苯迅速擦去，滴上一滴中性树胶于组织片上，然后取干净的盖玻片，在酒精灯烤干去除水分后仔细加在封固剂上，慢慢压平，使盖片位置适中。切片固定后，放于温箱中烤干，或平置晾干后装盒。
多聚-L-赖氨酸
蒸馏水
氯化钙
甘油明胶
钾明矾
1%氨水溶液
二甲苯
30%H2O2
100%、90%、80%、70%酒精
盐酸
40%甲醛
磷酸盐缓冲液（PBS）
TRIZOL试剂
氯仿
异丙醇
DEPC
TWEEN-20
琼脂糖粉末
溴化乙锭（EB）
乙酸钠
冰醋酸
ddH2O
RNase一freeHZO
5*TBE溶液
RT试剂盒
SYBRgreen荧光定量PCR试剂盒
(5)减少非特异性免疫结合反应:除去PBS液,每张切片加1滴或50ul正常非免疫动物
血清(试剂B),室温下孵育约10min。
(6)滴加一抗:每标本切片加1滴兔抗鼠p38MAPK,4℃过夜。PBS缓冲液洗5min*3次。
(7)滴加二抗:每标本切片加1滴生物素化二抗,室温30min，PBS缓冲液洗5min*3次。
塑料器皿也可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
(2)玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,0.1%DEPC过夜,蒙锡纸,150℃烘烤4h,180℃2h。或泡酸过夜,冲洗干净后高温烘烤,0.1%DEPC过夜,高压。
(3)金属制品:清洗干净后180℃烘烤6一8小时
(4)新橡胶制品:将新橡胶制品全Hale Waihona Puke Baidu浸入0.5mol/L氢氧化钠溶液煮沸15min后,流水冲洗;再浸入0.5mol/L盐酸溶液中煮沸10min,流水冲洗，再浸入自来水中煮沸2次,蒸馏水中煮沸20min后,60℃烘干箱内烘干备用。
凝胶图像分析仪
多功能高速冰冻离心机
台式高速离心机
微量移液器
荧光定量PCR仪
水平型电泳仪
紫光分光光度计
酶标仪
PCR-02-C薄壁管
EP管、Tip接头
移液器吸头
吸头台
PCR八联排管
数码相机
一次性无菌注射器（5ml和10ml）、口罩及手套
各种手术器械
主要试剂及配置：
链脲佐菌素（STZ)
10%水合氯醛
2.5%戊二醛固定液
（5）二甲苯Ⅰ20分钟→二甲苯Ⅱ20分钟
（6）石蜡Ⅰ1小时→石蜡Ⅱ1小时→石蜡Ⅲ1小时（熔点60°）
（7）硬蜡包埋
HE染色
整个染色过程包括5个内容：脱蜡，染色，脱水，透明和固封。
（1）、脱蜡：
a、60℃烤箱烤片30分钟
b、二甲苯Ⅰ10分钟
c、二甲苯Ⅱ10分钟
d、100%酒精5分钟×2
e、90%酒精5分钟
离心5min,弃上清,注意不要倒出沉淀,尽量吸尽残留乙醇。
(8)室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5一10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25一200ul无RNase的水,用枪头吸打几次,放置10分钟使RNA溶解,-80℃保存。
总RNA完整性及纯度鉴定
取lul总RNA溶液溶于49ul无RNA酶水中,用紫光分光光度计测总RNA在260nm及280nm的吸收值,根据公式计算RNA量:RNA(ug/ml)=260nm吸收值*稀释倍数*40;同时计算260nm/280nm吸收值的比值,在1.8一2.1之间表明RNA纯度较高,无DNA、蛋白质等的污染。若低于此范围,可能有蛋白质或有机溶剂污染,此时可用酚一氯仿重新抽提一次;若高于此范围可能有异硫氰酸肌污染,可用异丙醇去除。
(8)滴加试剂链霉素抗生物素一过氧化物酶溶液,室温20min，PBST缓冲液洗5min*3
次。
(9)加显色剂:DAB显色,镜下控制反应时间,一般在1一5分钟之间，蒸馏水稍冲后
流水5min。
(10)苏木素轻度复染30sec,1%盐酸乙醇溶液分化5sec，流水5min。
(11)脱水:80%、95%乙醇各2min,无水乙醇(I)(11)5min脱水,二甲苯(I)(11)
荧光定量PCR
实验前准备(去除RNA酶)
(1)塑料制品(包括枪头、EP管、匀浆管等):先将0.1%DEPC水倒入瓷缸中,将塑料制
品逐个浸泡其中,小枪头需打入DEPC水,室温过夜,121℃高压灭菌20min,再次置于60
℃烘干箱内烘干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)。胶塞同样处理。
液氮
P38MAPK兔IgG多克隆抗体（即用型）
柠檬酸盐抗原修复液（100*）PH=6.0
苏木素染液（即用型）
中性树胶
S-P免疫组化染色试剂盒包括：试剂A：内源性过氧化酶阻断剂（无色）
试剂B：动物非免疫血清（羊）（蓝色）
试剂C：生物素标记的羊抗兔IgG（黄色）
试剂D：链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（红色）
各5min透明。
(12)中性树胶封片:
阴性对照:用PBS代替一抗,其余操作相同。
自身对照:用相同部位免疫组化复染片作图像分析片的自身对照。
(13)显微镜观察,图像分析。
p38MAPK在心脏组织表达的半定量分析
每个时间点每组随机抽取不同切片5张,每张切片于光镜下(x200)随机选取5个视野,固定窗口面积,利用Q一win图像分析系统,测定平均灰度值以表示阳性产物的强度。平均灰度值越低,其阳性反应产物的强度越强,表明蛋白含量越高。
1%琼脂糖电泳凝胶：取电泳级琼脂糖粉1.0克，加入1*TAE电泳缓冲液100ml后，微波炉中加热煮沸使琼脂糖颗粒完全融化，室温下冷却约至40℃后，向瓶内加10mg/mlEB 5ul混匀即可。
心脏组织石蜡包埋
（1）70%酒精8小时
（2）80%酒精6小时
（3）90%酒精Ⅰ2小时→90%酒精Ⅱ2小时
（4）100%酒精Ⅰ1小时→100%酒精Ⅱ1小时
B：缓冲液（20*）
C：底物H2O2（20*）
在显色前30分钟，按顺序取每种试剂各一滴（50ul）加入850ul蒸馏水中，配成即用型的DAB显色剂。
主要试剂配制：
4%甲醛固定液：40%甲醛1份
蒸馏水9份
伊红水溶液：伊红0.5克
蒸馏水100毫升
氯化钙0.5克
乙醇、70%乙醇、蒸馏水各2min,PBS(PH7.4)3min*3次
(3)热修复:浸于柠檬酸盐缓冲液中,微波,中高火7min,凉至室温。PBS缓冲液洗5min
*3次。
(4)灭活内源性酶:每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断剂(试剂A),室温下孵育
约10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次,每次5min。
f、80%酒精5分钟
g、70%酒精5分钟
h、流水冲洗5分钟
（2）、染色：
a、苏木素染色，一般以稍深染为宜5分钟
b、流水冲洗，洗去苏木素和浮色5分钟
c、1%盐酸酒精，分化几秒至30秒，使切片褪色至淡蓝红色即可
d、流水冲洗，洗涤30～60分钟，使组织呈鲜蓝色或天蓝色
e、伊红染色1分钟
f、流水冲洗10分钟，洗去伊红浮液，并用纱布擦净玻片上多余的染料
(5)4℃、10000rPm离心15min。样品分为三层:上层为无色水相和一个中间层,底层为黄
色有机相,RNA主要在水相中,小心取上清,转至新的Ep管。
(6)用等体积异丙醇沉淀水相中的RNA。混匀后室温孵育10min,4℃、12000rPm条件下离
心10min,弃上清液。
(7)75%乙醇(DEPC水处理)洗涤沉淀一次(至少lm175%乙醇/mlTRIZOL),4℃、7500rpm,
0.1%DEPC溶液:新鲜烧制的三蒸水500ml，加入DEPC溶液0.5ml，胶塞封口后用力震荡使DEPC溶液充分混匀溶解，37℃放置过夜，在15psi条件下高压灭菌20分钟，使残余的DEPC失活。
75%酒精配制（0.1%DEPC处理）：取75ml无水乙醇与25ml三蒸水混合即可，每次使用前新鲜配制，置于-20℃预冷。
取5u1RNA,在1%琼脂糖凝胶上电泳,质量好的RNA电泳后可见2~3条带,分别为28S、18S和5SRNA,无拖尾现象,表明抽提的总RNA是完整的。
用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIZOL体积10%。充分碾磨,直至无明显可见
的颗粒。碾磨过程中,注意冰上操作。
(2)将匀浆样品室温(15一30℃)放置5min,使核酸蛋白复合物分离。
(3)4℃、12000rpm条件下离心20min后,取上清,转至新的Ep管中。
(4)每使用lmlTRIZOL加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15Sec,使之充分混匀后室温放置3min
实验主要仪器：
石蜡切片机
光学显微镜及成像系统
解剖显微镜
正立荧光显微镜
血糖仪及血糖试纸
XYJ-1烤片机
普通家用冰箱
超低温冰箱
恒温水浴箱
隔水式电热恒温培养箱
自动旋转式混匀仪
电热恒温鼓风干燥箱
高温高压蒸汽消毒锅
分析电子天平
微波炉
数字式酸度计
磁力搅拌机
SW-CJ-2F型双面超净工作台
Shandon Histocentre 3型脱水包埋机
1%盐酸乙醇溶液：浓盐酸1ml
80%乙醇99ml
2%戊巴比妥溶液：戊巴比妥2克
蒸馏水100ml
3%甲醇-H2O2溶液：30%H2O2 1份
甲醇9份
PBS缓冲液（PH=7.2~7.6）氯化钠8.5克
磷酸氢二钠2.8克
磷酸二氢钠0.4克
蒸馏水1000ml
PBST溶液：PBS溶液中加入TWEEN-20，按照1000:1的比例配制而成。TWEEN是一种离子表面活性剂，它可加速抗体非特异性结合的分离，PBST较PBS可将多余的抗体洗脱的更为彻底，背景更为清晰。
5)溶液:全部采用新鲜三蒸水配制,并按照0.1%的比例加入DEPC水处理过夜,121℃高压灭菌20min后储存备用。
总RNA的提取
实验全程中注意冰上操作,离心机提前预冷,操作者应在无菌工作台工作,避免RNA分解酶的污染。
采用TRIZOL试剂提取心脏组织总RNA,具体步骤如下:
(1)匀浆处理:将心脏组织在己充分预冷的匀浆器中磨碎,每50一100mg组织加入lmlTRIZOL,
免疫组化检测
(l)载玻片处理(多聚一L一赖氨酸法):
将充分洗净、干燥的载玻片浸泡于500ug/ml的多聚一L一赖氨酸(wt.>l50,000)溶液内数十秒或提拉十次,然后取出,于室温下放置12~24小时自然晾干,或在45℃以下烤箱内烘干,处理后的玻片保存于避光干燥的条件下可长期使用"
(2)脱蜡:二甲苯(I)(11)各15min脱蜡,无水乙醇(I)(11)各5min,95%乙醇、80%
（3）、脱水：
a、吸去玻片上的水分后移入80%酒精中脱水，约1～2分钟
b、移入90%酒精中脱水约2～4分钟
c、移入无水酒精中彻底脱水，约4～8分钟
（4）、透明：
a、移入二甲苯Ⅰ中透明3～5分钟。
b、移入二甲苯Ⅱ中透明5～10分钟。
（5）、封固：
用中性树胶封固。先从二甲苯Ⅱ中取出切片，将组织外围的二甲苯迅速擦去，滴上一滴中性树胶于组织片上，然后取干净的盖玻片，在酒精灯烤干去除水分后仔细加在封固剂上，慢慢压平，使盖片位置适中。切片固定后，放于温箱中烤干，或平置晾干后装盒。
多聚-L-赖氨酸
蒸馏水
氯化钙
甘油明胶
钾明矾
1%氨水溶液
二甲苯
30%H2O2
100%、90%、80%、70%酒精
盐酸
40%甲醛
磷酸盐缓冲液（PBS）
TRIZOL试剂
氯仿
异丙醇
DEPC
TWEEN-20
琼脂糖粉末
溴化乙锭（EB）
乙酸钠
冰醋酸
ddH2O
RNase一freeHZO
5*TBE溶液
RT试剂盒
SYBRgreen荧光定量PCR试剂盒
(5)减少非特异性免疫结合反应:除去PBS液,每张切片加1滴或50ul正常非免疫动物
血清(试剂B),室温下孵育约10min。
(6)滴加一抗:每标本切片加1滴兔抗鼠p38MAPK,4℃过夜。PBS缓冲液洗5min*3次。
(7)滴加二抗:每标本切片加1滴生物素化二抗,室温30min，PBS缓冲液洗5min*3次。
塑料器皿也可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
(2)玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,0.1%DEPC过夜,蒙锡纸,150℃烘烤4h,180℃2h。或泡酸过夜,冲洗干净后高温烘烤,0.1%DEPC过夜,高压。
(3)金属制品:清洗干净后180℃烘烤6一8小时
(4)新橡胶制品:将新橡胶制品全Hale Waihona Puke Baidu浸入0.5mol/L氢氧化钠溶液煮沸15min后,流水冲洗;再浸入0.5mol/L盐酸溶液中煮沸10min,流水冲洗，再浸入自来水中煮沸2次,蒸馏水中煮沸20min后,60℃烘干箱内烘干备用。
凝胶图像分析仪
多功能高速冰冻离心机
台式高速离心机
微量移液器
荧光定量PCR仪
水平型电泳仪
紫光分光光度计
酶标仪
PCR-02-C薄壁管
EP管、Tip接头
移液器吸头
吸头台
PCR八联排管
数码相机
一次性无菌注射器（5ml和10ml）、口罩及手套
各种手术器械
主要试剂及配置：
链脲佐菌素（STZ)
10%水合氯醛
2.5%戊二醛固定液
（5）二甲苯Ⅰ20分钟→二甲苯Ⅱ20分钟
（6）石蜡Ⅰ1小时→石蜡Ⅱ1小时→石蜡Ⅲ1小时（熔点60°）
（7）硬蜡包埋
HE染色
整个染色过程包括5个内容：脱蜡，染色，脱水，透明和固封。
（1）、脱蜡：
a、60℃烤箱烤片30分钟
b、二甲苯Ⅰ10分钟
c、二甲苯Ⅱ10分钟
d、100%酒精5分钟×2
e、90%酒精5分钟
离心5min,弃上清,注意不要倒出沉淀,尽量吸尽残留乙醇。
(8)室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5一10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25一200ul无RNase的水,用枪头吸打几次,放置10分钟使RNA溶解,-80℃保存。
总RNA完整性及纯度鉴定
取lul总RNA溶液溶于49ul无RNA酶水中,用紫光分光光度计测总RNA在260nm及280nm的吸收值,根据公式计算RNA量:RNA(ug/ml)=260nm吸收值*稀释倍数*40;同时计算260nm/280nm吸收值的比值,在1.8一2.1之间表明RNA纯度较高,无DNA、蛋白质等的污染。若低于此范围,可能有蛋白质或有机溶剂污染,此时可用酚一氯仿重新抽提一次;若高于此范围可能有异硫氰酸肌污染,可用异丙醇去除。
(8)滴加试剂链霉素抗生物素一过氧化物酶溶液,室温20min，PBST缓冲液洗5min*3
次。
(9)加显色剂:DAB显色,镜下控制反应时间,一般在1一5分钟之间，蒸馏水稍冲后
流水5min。
(10)苏木素轻度复染30sec,1%盐酸乙醇溶液分化5sec，流水5min。
(11)脱水:80%、95%乙醇各2min,无水乙醇(I)(11)5min脱水,二甲苯(I)(11)
荧光定量PCR
实验前准备(去除RNA酶)
(1)塑料制品(包括枪头、EP管、匀浆管等):先将0.1%DEPC水倒入瓷缸中,将塑料制
品逐个浸泡其中,小枪头需打入DEPC水,室温过夜,121℃高压灭菌20min,再次置于60
℃烘干箱内烘干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)。胶塞同样处理。
液氮
P38MAPK兔IgG多克隆抗体（即用型）
柠檬酸盐抗原修复液（100*）PH=6.0
苏木素染液（即用型）
中性树胶
S-P免疫组化染色试剂盒包括：试剂A：内源性过氧化酶阻断剂（无色）
试剂B：动物非免疫血清（羊）（蓝色）
试剂C：生物素标记的羊抗兔IgG（黄色）
试剂D：链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（红色）
各5min透明。
(12)中性树胶封片:
阴性对照:用PBS代替一抗,其余操作相同。
自身对照:用相同部位免疫组化复染片作图像分析片的自身对照。
(13)显微镜观察,图像分析。
p38MAPK在心脏组织表达的半定量分析
每个时间点每组随机抽取不同切片5张,每张切片于光镜下(x200)随机选取5个视野,固定窗口面积,利用Q一win图像分析系统,测定平均灰度值以表示阳性产物的强度。平均灰度值越低,其阳性反应产物的强度越强,表明蛋白含量越高。
1%琼脂糖电泳凝胶：取电泳级琼脂糖粉1.0克，加入1*TAE电泳缓冲液100ml后，微波炉中加热煮沸使琼脂糖颗粒完全融化，室温下冷却约至40℃后，向瓶内加10mg/mlEB 5ul混匀即可。
心脏组织石蜡包埋
（1）70%酒精8小时
（2）80%酒精6小时
（3）90%酒精Ⅰ2小时→90%酒精Ⅱ2小时
（4）100%酒精Ⅰ1小时→100%酒精Ⅱ1小时