022蛋白质的一级结构

N-端氨基酸
C-端氨基酸
H+
RO
Rn O
NH2NH2H2N CH C NHNH2 +H2N CH C OH
氨基酸酰肼
C-端氨基酸
C-端氨基酸分析法--羧肽酶 (carboxypeptidase)法 p171
n 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链 的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时 间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数 量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。
n 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A 和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包 酵母。
一 用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使
级 结 构
二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂 （ICH2COOH）保护生成的巯基，以
的 防止它重新被氧化。
测
定
SH-CH2-CH2-OH
(2) 测定步骤
n 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之
蛋 间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分 白 多肽链间的二硫键。
质 一
C-端氨基酸分析法--肼解法 p170
n 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水 条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其 余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩 合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。
RO H2N CH C
Rn-1O
Rn O
HN CH C HN CH C OH
O
作用：这些反应可用于巯基的保护。
SS
S
S
S
S
胰岛素
SH
HSHO-CH2-CH2-SH
SH
SH
SH
SH
ICH2COOH SCH2C00HSCH2C00H
SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H
(2) 测定步骤
D.分析多肽链的N-末端和C-末端。
蛋 p169
白 质 一
n 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物
能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色
谱法进行鉴定。 RO
RO
O2N
F +H2N CH C
O2N
HN CH C
NO2 DNFB
H+ H2O
O2N
N-端氨基酸 RO
HN CH C OH
NO2 DNP-氨基酸
NO2 DNP衍生物
+
氨基酸
N-端氨基酸分析法-丹磺酰氯法(DNS)
蛋 几条多肽链借助非共价键连接在一起，
白 质 一
称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚 体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L
级 尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开
结 构
多肽链(亚基).
的
测
定
(2) 测定步骤
C.二硫键的断裂 p169
蛋 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可
白 质
在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，
n 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约 6000到1000000道尔顿甚至更大。
示例
虾红素
木瓜蛋白酶
组织蛋白酶
一、蛋白质的一级结构p168
1. 定义—— 1969年，国际 纯化学与应用化学委员会 （IUPAC） 规定：蛋白 质的一级结构指蛋白质多 肽连中AA的排列顺序，包
括二硫键的位置。其中最 重要的是多肽链的氨基 酸顺序，它是蛋白质生 物功能的基础。
n
多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基 酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。
级 结 构
n
在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是 N-端氨基酸分苯（DNFB）法
n Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与 肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物 （DNP）。p169
羟基化反应）
N-端氨基酸分析法-氨肽酶(amino
peptidases)法 p170
n 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽 链的N-端逐个的向里水解。
n 根据不同的反应时间测出酶水解所释放 出的氨基酸种类和数量，按反应时间和 氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而 知道蛋白质的N-末端残基顺序。
n 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解 以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最 大。
n 在碱性条件下，丹磺酰氯（二p甲1氨6基9萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸
的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。
n 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以 达到110-9mol。
N(CH3)2
RO
+ H2N CH C
SO2Cl 丹磺酰氯
多肽N-端 N(CH3)2
N(CH3)2
RO SO2 HN CH C 丹磺酰N-端氨基酸
2.蛋白质一级结构的测定
n 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学 研究的基础。自从1953年F.Sanger测定 了胰岛素的一级结构以来，现在已经有 上千种不同蛋白质的一级结构被测定。
（1）测定蛋白质一级结构的要求 p168
a、样品必需纯（>97%以上）； b、知道蛋白质的分子量； c、知道蛋白质由几个亚基组成；
(2) 测定步骤 p168
A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。
蛋 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋
白 质
白质分子量之间的关系，即可确定多肽
一 链的数目。
级
结
构
的
测
定
（2）测定步骤
B.多肽链的拆分。p169
蛋 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须
白 质
先进行拆分。
一
级
结
构
的
测
定
( 2) 测定步骤
B.多肽链的拆分。p169
蛋白质的分子结构
一、蛋白质的一级结构 二、蛋白质的二级结构和纤维状蛋白 三、蛋白质的三级结构 四、蛋白质的四级结构
蛋白质的结构
n 蛋白质是由一条或多条多肽 (polypeptide)链以特殊方式结合而成的 生物大分子。
n 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是 将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为 蛋白质。
水解
+ RO SO2 HN CH C OH 丹磺酰氨基酸
氨基酸
N-端氨基酸分析法 苯异硫氰酸酯法(PITC)
p137,170
AA PITC+ 多肽
蛋白
弱碱
AA
PTC—多肽
无水甲酸 蛋白
或HF
PTH-AA + 少一个AA的多肽或蛋白
用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基
酸. （苯异硫氰酸酯法） Edman反应（α-氨基
级
结
构
的
测
定
s s
HcoooH SO3H
SO3H
-SH
巯 基 （ ） 的 保 护
-OOC CHCH2 SH NH3+
O
C H 2 O C C-O l OC CHCH2 SOCCH2
NH3+
O
CH2Cl
-OOC CHCH2 SCH2
O
NH3+
ICH2CNH2 -OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+