大豆蛋白的提取及与含量测定

(4)、 Folin试剂乙：在 2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠

（NaWO4· 2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO· 2M2O）25g，蒸馏水700ml， 85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时， 再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸 腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金 黄色，于棕色并中保存，可使用多年。 上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右，几种 操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的酸度作为应用液， 我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1mol/L略高。 这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液，Folin试 剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用Folin试剂 乙去滴定1mol/L左右的标准NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰 色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定Folin乙，终 点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫 色为终点。
试剂和器材
1、材料：

本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至
可测定范围。
2、试剂：

（1）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。
（2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 称 取 0 . 5 g 酒 石 酸 钾 钠 溶 于 8 0 mlH2O 中 ， 再 加 0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到500ml，冰 箱保存可用一个月。
制丙酮干粉时的注意事项
加入丙酮及加酸调pH时，都要边 加边搅 丙酮一定要远离明火 调pH时，不许调过头.
制丙酮干粉，要少量多次加入丙酮后，将沉淀充分搅起。
1
0.9
0.8 1
0.6 1
0.4 1
0.2 1
0 1
Folin-甲试剂 （ml
）
1
1
于室温下不停地振荡10min
Folin-乙应用液（ml）
4
4
4
4
4
4
4
立即摇匀，在55℃恒温水浴中保温5min，用流水冷却1min后，测A650
A650值
`
2、样品测定：取两支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品 液1ml（不加buffer），其他操作同工作曲线（可取两支试管编 号8、9，与工作曲线同时进行反应和比色测定）；
三、试剂、材料及仪器
1 . 0 . 2 % 的 NaOH； 3. 1mol/L的HCl 5. 市售大豆粉 7. 天平 9. 离心内、外套管 11.搅拌棒
2. 6mol/L 的 HCl； 4. 化学纯级丙酮 6. 精密pH 试纸 8. 离心机（普通） 10.烧杯
四、实验步骤
提取：.称取3克大豆粉，用0.2%NaOH
Folin酚法测定蛋白质含量


目的要求 掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法实验原理 蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫 外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定 氮、双缩脲反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其 中双缩脲法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法， 它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。 Folin酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。 Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双 缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙 中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类 还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。

五、注意事项（离心机使用注意）
1.检查离心内、外套管应完整不漏，洗净离心管； 2.待离心的物质装入离心管的量不应超过离心内套管体积的2/3； 3.将一对离心管（含内、外套管）放在台秤上平衡，可调节离心管内容物 的量，也可在内、外管间加水缓冲平衡； 4.检查离心机可正常工作后，将一对平衡好的离心管按对称的位置放在离 心机中； 5.盖好离心机盖，打开电源开关，慢慢拨动变速旋钮（从0开始），使速度 逐渐增加，记时，离心结束后，一定先将变速旋钮慢慢拨到0位，再关电源； 待离心机停止运转后，再打开离心机盖，取出离心管，不许用手强行使离 心机停止转动！ 6．用完后，将内外套管洗净，倒立放置，使其干燥，并在使用的登记薄签 名。 7.使用过程中，如出现故障，一定请本室的实验员排除，不许擅自处理。
Pr(mg/ml)=



思考题
1、采用Folin的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物 质对测定结果有干扰？ 2、作为标准蛋白的酪蛋白在应用时有何要求。
五、注意事项


（一）使用离心机的方法及注意事项：
离心机的工作原理是：在离心力场的作用下，可加速悬浮液中固体 颗粒沉降或漂浮的速度，从而将不同的物质分离；离心机是生化实验中 经常用于提取、分离、纯化的常用设备，其操作中的关键环节是平衡， 具体的使用方法及注意事项如下（由在各室上课的教师结合本室离心机 进行现场指导）：
试管号
蛋白质稀释液（ml） （mg)
PH7.8的buffer（ml）
8
1 0 1 0 1 4
9
Folin-甲试剂 （ml
）
1
于室温下不停地振荡10min
Folin-乙应用液（ml）
4
立即摇匀，在55℃恒温水浴中保温5min，用流水冷却1min后，测A650
A650值

蛋白质浓度的计算： A650值对应的mg数(Pr) ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
大豆蛋白的提取及与含量测定
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一、目的要求
1. 学习掌握离心机、752N、天平的使
用方法和注意事项； 2.学习掌握大豆蛋白的提取及制备丙 酮干粉的原理和方法； 3 .学习计算蛋白质收率,测定蛋白质 含量
二、实验原理（一）
1.大豆蛋白的等电点为4.5-5.0是酸性蛋白，尽管大 豆中含有水溶蛋白、盐溶蛋白、碱溶蛋白和醇溶蛋白， 但其主要成分为碱溶蛋白，本实验为节省丙酮用量只 进行碱提； 2.丙酮（有机溶剂）可降低溶液的介电常数、破坏蛋 白质的水化膜，故可使蛋白质在一定条件下沉淀析出； 调节蛋白质溶液的pH值到等电点附近，有利于蛋白质 的沉淀。
30毫升。 （先加入调成糊状，再用少量多次地慢慢地加 入（边加边搅拌） NaOH溶液），室温下搅拌 抽提15min，于6000r/min离心7min ,小心留取 上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物， 再经过滤； 留出上清液2毫升稀释50、100倍做含量测定
三、实验步骤

制干粉：量上清液的体积，加入等体积在冰箱中预冷 的丙酮，先用6mol/L的HCl调pH至6.0，再用1mol/L的 HCl小心调pH至4.5-5.0，于4000r/min离心15min， (留取沉淀物)，并用少量丙酮反复(至少两次)搅拌洗 涤（在离心管中进行），加入丙酮后一定将沉淀搅拌 充分，加入丙酮目的使沉淀脱水。得到白色粉末状的 大豆蛋白粉（上清液回收），用干净的滤纸吸干、平 铺在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整个实验结束 后，再称重并计算产率。



由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶液 兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系 。因此用 Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样 品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的 浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸的色氨酸的浓度。 Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个， 只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温 时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的， 灵敏度较高的操作方法。3、器材： Fra bibliotek
试管10支 试管架一个 移液管：（5ml、1ml） 移液管架 洗瓶 恒温水浴 752N型分光光度计
操作方法

标准曲线的制作： 标准酪蛋白溶液：用0.03mol/L的磷酸缓冲液溶解的酪蛋白，浓度为 200μg/ml。用一支0.5ml移液管分别取上述标准酪蛋溶液0ml, 0.1ml， 0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml各加到一支试管中去，将此吸管用 0.03mol/LPH7.8的磷酸缓冲液，反复洗净，再用同一支移液管（防止未经 标定吸量管的相对误差的影响）取上述缓冲液将每支试管中的溶液补加至 1ml。再在另一支试管中加入1ml缓冲液作空白对照。于上述试管中各加入 1mlFolin试剂甲并不时地进行振荡，10min后再加入后1in试剂乙的应用液4 毫升。立既摇匀放入55℃水溶中保湿5min。取出后用自来水冷却1min。于 波长650nm进行比色测定各管的OD值，以蛋白质的浓度为横坐标，OD值为纵 坐标，既可得到标准曲线。
Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作： 取7支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测 定
试管号
蛋白质标准液（ml） （mg)
1
0 0
2
0.1 0.02
3
0.2 0.04 0.4 0.08
4
5
0.6 0.12
6
0.8 0.16 1.0 0.2
7
PH7.8的buffer（ml）