测序技术的个体化医学检测应用技术指南(试行)
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测序技术的个体化医学检测 应用技术指南（试行）
前
言
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随着人们对疾病分子机理的认识，以及测序技术的不断发展和完善，已促使 基因测序技术走入临床实验室。 通过基因测序的方法可以对较长的基因片段进行 检测，并可一次性发现基因多态性、点突变、小片段缺失等多种复杂基因变异类 型，因此已经被广泛应用多种分子诊断领域，包括癌症检测（遗传性癌症的致病 基因检测、癌症易感性基因、或靶向性抗肿瘤药物的靶点基因检测等） ，遗传学 检测（遗传病的诊断和携带者检测） ，药物基因组学检测（根据药代动力学和 / 或药效动力学相关基因的遗传背景差异，为患者量体裁衣式地提供疗效更好、毒 副作用更低的个体化治疗方案）和微生物检测（病毒基因分型，耐药基因检测） 等。 近年来随着新一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的不断发展 和检测成本的持续下降，NGS 也已经发展成为重要的临床基因分析技术。NGS 的本质是大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS） ，作为一个广义 的范畴， 包括许多原理各异、 但都可以一次性产生大量数字化基因序列的多种测 序技术。相对 Sanger 测序而言，NGS 技术流程较为复杂，最重要的区别就是必 须依赖下游的生物信息学处理过程， 才能将从测序仪获得的原始数据转换成可以 用于临床解读的 DNA 序列，因此需要同时配备专业的技术人才、临床专家和信 息分析专家， 而且对场地和环境要求高。目前很多大中型医学实验室已经开始使 用 NGS 开发各种检测项目， 包括遗传疾病诊断，癌症和传染性疾病基因检测等。 其他还有可能用于临床的检测项目还包括全基因组甲基化分型、微生物组、宏基 因组/泛基因组，以及转录组测序等。 目前已经用于临床检测的基因测序项目绝大多数都属于实验室自主研发项 目 （laboratory developed tests，LDT） ，因此，为了确保所获得的序列和结果分 析能够用于指导临床决策，需要对测序的全过程，包括样品处理、检测步骤和数 据解读等诸多方面进行标准化。本指南从样品采集、运输、接收、处理、检测、 检测项目的开发、检测的验证（verification）与确认（validation） 、室内及室间质 量控制需遵循的基本原则、 结果报告和解释， 以及可能出现的问题及应对措施等， 为基于测序技术的个体化医学检测应用提供标准化指导。
6. 测序技术概述与应用................................................................................................................ 11 6.1 测序技术概述 ................................................................................................................... 11 6.2 测序技术的应用 ............................................................................................................... 15 7. 样品处理 ................................................................................................................................... 19 7.1 样品采集、运送和保存 .................................................................................................... 20 7.2 核酸提取方法及质控 ....................................................................................................... 21 7.3 检测后样品的保存和处理 ............................................................................................... 22 8. 测序模板制备 ........................................................................................................................... 22 8.1 Sanger 测序的模板制备 ................................................................................................... 24 8.2 大规模平行测序（NGS）的测序文库构建................................................................... 24 8.3 特殊测序模板准备时的注意事项 ................................................................................... 27 8.4 采用 NGS 进行多样品混合检测（sample multiplexing） .......................................... 28 9. 测序步骤与可能存在的问题.................................................................................................... 28 9.1 检测方法概述 .................................................................................................................... 28 9.2 测序方法和仪器的选择 .................................................................................................... 29 9.3 测序技术的潜在缺陷或特征可能导致的问题 ................................................................ 32 9.4 碱基识别和质量值 ........................................................................................................... 32 10. 原始测序结果的比对，拼接和评价...................................................................................... 36 10.1 Sanger 测序 ..................................................................................................................... 37 10.2 NGS 测序 ........................................................................................................................ 40 10.3 单分子测序 ..................................................................................................................... 52 11.质量保证和质量控制 ................................................................................................................ 53 11.1 质量保证和质量控制的定义和要求 .............................................................................. 53 11.2 数据评价 .......................................................................................................................... 53
11.3 序列软件评估和检验 ..................................................................................................... 57 11.4 NGS 检测实验室的质量管理体系 ................................................................................. 57 12.检测结果解读与报告................................................................................................................ 63 12.1 检测结果的临床解读 ...................................................................................................... 63 12.2 检测报告 .......................................................................................................................... 66 12.3 检测结果回报时间（turnaround time，TAT） ......................................................... 67 12.4 检测报告的机密性 .......................................................................................................... 67 12.5 检测记录的保存和患者报告的可追溯性 ...................................................................... 68 13.NGS 检测实验室的评估与准入 .............................................................................................. 68 13.1 NGS 检测实验室的资质要求......................................................................................... 69 13.2 实验室的设施与设备及整体要求 .................................................................................. 69 13.3 实验室的质量控制管理体系评估 .................................................................................. 70 13.4 SOP 编写 ......................................................................................................................... 71 13.5 实验室的检测报告与服务效率 ...................................................................................... 72 13.6 实验室人员培训 .............................................................................................................. 72 附录 A 目前市场主流测序平台的主要性能与技术参数比较 .................................................... 73 附录 B 面向公众开放的 NGS 数据分析软件包 .......................................................................... 74 附录 C NGS 检测实验室评估表 .................................................................................................. 76 参考文献 ........................................................................................................................................ 78
目
1. 2. 3. 4. 5.
录
摘要 ............................................................................................................................................. 1 本指南适用范围.......................................................................................................................... 1 简介 ............................................................................................................................................. 1 标准声明/警告 ............................................................................................................................ 2 标准术语和缩略语...................................................................................................................... 2 5.1 标准术语 ............................................................................................................................. 2 5.2 缩略语 ............................................................................................................................... 10
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随着人们对疾病分子机理的认识，以及测序技术的不断发展和完善，已促使 基因测序技术走入临床实验室。 通过基因测序的方法可以对较长的基因片段进行 检测，并可一次性发现基因多态性、点突变、小片段缺失等多种复杂基因变异类 型，因此已经被广泛应用多种分子诊断领域，包括癌症检测（遗传性癌症的致病 基因检测、癌症易感性基因、或靶向性抗肿瘤药物的靶点基因检测等） ，遗传学 检测（遗传病的诊断和携带者检测） ，药物基因组学检测（根据药代动力学和 / 或药效动力学相关基因的遗传背景差异，为患者量体裁衣式地提供疗效更好、毒 副作用更低的个体化治疗方案）和微生物检测（病毒基因分型，耐药基因检测） 等。 近年来随着新一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的不断发展 和检测成本的持续下降，NGS 也已经发展成为重要的临床基因分析技术。NGS 的本质是大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS） ，作为一个广义 的范畴， 包括许多原理各异、 但都可以一次性产生大量数字化基因序列的多种测 序技术。相对 Sanger 测序而言，NGS 技术流程较为复杂，最重要的区别就是必 须依赖下游的生物信息学处理过程， 才能将从测序仪获得的原始数据转换成可以 用于临床解读的 DNA 序列，因此需要同时配备专业的技术人才、临床专家和信 息分析专家， 而且对场地和环境要求高。目前很多大中型医学实验室已经开始使 用 NGS 开发各种检测项目， 包括遗传疾病诊断，癌症和传染性疾病基因检测等。 其他还有可能用于临床的检测项目还包括全基因组甲基化分型、微生物组、宏基 因组/泛基因组，以及转录组测序等。 目前已经用于临床检测的基因测序项目绝大多数都属于实验室自主研发项 目 （laboratory developed tests，LDT） ，因此，为了确保所获得的序列和结果分 析能够用于指导临床决策，需要对测序的全过程，包括样品处理、检测步骤和数 据解读等诸多方面进行标准化。本指南从样品采集、运输、接收、处理、检测、 检测项目的开发、检测的验证（verification）与确认（validation） 、室内及室间质 量控制需遵循的基本原则、 结果报告和解释， 以及可能出现的问题及应对措施等， 为基于测序技术的个体化医学检测应用提供标准化指导。
6. 测序技术概述与应用................................................................................................................ 11 6.1 测序技术概述 ................................................................................................................... 11 6.2 测序技术的应用 ............................................................................................................... 15 7. 样品处理 ................................................................................................................................... 19 7.1 样品采集、运送和保存 .................................................................................................... 20 7.2 核酸提取方法及质控 ....................................................................................................... 21 7.3 检测后样品的保存和处理 ............................................................................................... 22 8. 测序模板制备 ........................................................................................................................... 22 8.1 Sanger 测序的模板制备 ................................................................................................... 24 8.2 大规模平行测序（NGS）的测序文库构建................................................................... 24 8.3 特殊测序模板准备时的注意事项 ................................................................................... 27 8.4 采用 NGS 进行多样品混合检测（sample multiplexing） .......................................... 28 9. 测序步骤与可能存在的问题.................................................................................................... 28 9.1 检测方法概述 .................................................................................................................... 28 9.2 测序方法和仪器的选择 .................................................................................................... 29 9.3 测序技术的潜在缺陷或特征可能导致的问题 ................................................................ 32 9.4 碱基识别和质量值 ........................................................................................................... 32 10. 原始测序结果的比对，拼接和评价...................................................................................... 36 10.1 Sanger 测序 ..................................................................................................................... 37 10.2 NGS 测序 ........................................................................................................................ 40 10.3 单分子测序 ..................................................................................................................... 52 11.质量保证和质量控制 ................................................................................................................ 53 11.1 质量保证和质量控制的定义和要求 .............................................................................. 53 11.2 数据评价 .......................................................................................................................... 53
11.3 序列软件评估和检验 ..................................................................................................... 57 11.4 NGS 检测实验室的质量管理体系 ................................................................................. 57 12.检测结果解读与报告................................................................................................................ 63 12.1 检测结果的临床解读 ...................................................................................................... 63 12.2 检测报告 .......................................................................................................................... 66 12.3 检测结果回报时间（turnaround time，TAT） ......................................................... 67 12.4 检测报告的机密性 .......................................................................................................... 67 12.5 检测记录的保存和患者报告的可追溯性 ...................................................................... 68 13.NGS 检测实验室的评估与准入 .............................................................................................. 68 13.1 NGS 检测实验室的资质要求......................................................................................... 69 13.2 实验室的设施与设备及整体要求 .................................................................................. 69 13.3 实验室的质量控制管理体系评估 .................................................................................. 70 13.4 SOP 编写 ......................................................................................................................... 71 13.5 实验室的检测报告与服务效率 ...................................................................................... 72 13.6 实验室人员培训 .............................................................................................................. 72 附录 A 目前市场主流测序平台的主要性能与技术参数比较 .................................................... 73 附录 B 面向公众开放的 NGS 数据分析软件包 .......................................................................... 74 附录 C NGS 检测实验室评估表 .................................................................................................. 76 参考文献 ........................................................................................................................................ 78
目
1. 2. 3. 4. 5.
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摘要 ............................................................................................................................................. 1 本指南适用范围.......................................................................................................................... 1 简介 ............................................................................................................................................. 1 标准声明/警告 ............................................................................................................................ 2 标准术语和缩略语...................................................................................................................... 2 5.1 标准术语 ............................................................................................................................. 2 5.2 缩略语 ............................................................................................................................... 10