第15章 综合分析

生物活性分子的分离与表征
第四部分 综合分析
第14章、蛋白质纯化策略
第15章、综合实例
第15章 综合实例
白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的 分离纯化及表征
类凝血酶介绍
许多蝮亚科蛇毒中都含有一种精氨酸酯酶， 它能使纤维蛋白原特定部位Arg-Gly肽键的断裂， 释放出血纤肽而转换为纤维蛋白，其作用与血 浆凝血酶十分相似，因此称之为类凝血酶 （Thrombin-like Enzyme，简称TLE）。
1
2
Buffer1： 20 mM Tris-HCI (pH9.1) Buffer2： Buffer1+0.5M NaCl 此处为何无酶活曲线？
蛋白质表征
分子量 N端序列测定 酶最适温度 酶最适pH
蛋白酶类型分析
SDS-PAGE鉴定蛋白纯度与分子量
算得酶I和酶II的分子量分别为34kDa和38kDa。
特性研究
使用的方法/技术
依赖于蛋白质的生物活性，包括特定活 性的确定，温度、pH值等对生物活性的 影响，配基相互作用研究等
功能描述
纯度证明
结构研究
确定分子量 一级结构分析 二级/三级、四级结 构分析 翻译后修饰分析
SDS-PAGE、等电聚焦、双向电泳、HPLC 分折、质谱和毛细管电泳
SDS-PAG、PAGE、凝胶过滤、分析超离 心和质谱 氨甚酸组成，肽图谱、、末端序列分析 和全部的氨基酸序列测定 圆二色性、荧光光潜、核磁共振、X射 线结晶学和分析超离心 种类繁多，依赖于确切的修饰方式
N端序列测定
①将SDS-PAGE得到的对应蛋白胶条剪下，并 按照胶大小取PVDF膜。 ②在转膜缓冲液中平衡胶和膜。 ③将6枚吸附垫浸于转膜缓冲液中至饱和， 将3枚吸附垫放于阳极板。
④小心地将膜置于饱和吸附垫上，用一个清洁 的玻璃吸管轻而缓地沿一个方向膜上滚动，除去膜 和吸附垫之间的气泡。 ⑤把胶放在膜上，用玻璃吸管轻而缓地沿一个方向 在胶上滚动，除去胶和膜之间的气泡。 ⑥将3枚吸附垫放到胶上，然后将阴极放在最上 面。 ⑦接电源，开始转膜。选择电流强度0.65mA/c 时，转膜90分钟。 ⑧将转膜后的PVDF膜用考马斯亮蓝R-250染色再 脱色后，将蛋白条带剪下测序。
10 min)取上清。
蛋白粗纯
(1)阳离子交换层析： 以1 mI/min的流速上样于SP Sepharose XL (1.6x8cm)，用缓冲液A (20 mmol/L磷酸 盐缓冲液，pH7.0)平衡，使得OD28o至基线 位置，然后进行线性洗脱，洗脱条件为:： 0-100% B液(20 mmo1/L磷酸盐缓冲液， pH7.0, 0.5 mol/LNaCI) 1ml/min, 150min。 每2ml收集一管，测定各组分精氨酸酯 酶活力并用SDS-PAGE分析各组分中的蛋白 组成。
0.4 ml/min的流速上样。
每3ml收集一管，检测各个组分的酶活力，
电泳分析蛋白组分。
Buffer：20 mM Tris-HCI, 0.15 M NaCI, pH 7.9
精细纯化
(3)阴离子交换层析 将凝胶过滤得到的活性组分进行超滤脱盐 并更换缓冲液，用缓冲液D ( 20 mmol/L Tris-HC1, pH9.1)平衡阴离子交换柱Mini Q，将超滤后得到 的蛋白组分以1 ml/min的速度上样，上样结束后， 用缓冲液D平衡，使得280 nm的吸光值至基线， 然后进行线性洗脱，线性洗脱条件为:0-100%缓 冲液E ( 20 mmo1/L Tris-HCl ,0.5 mol/L NaCI, pH9.1)， 0.4 mL/min, 40 min洗脱。 收集洗脱峰，进行纤维蛋白原凝结活性检测， 并用SDS-PAGE分析各个组分的蛋白成分。
检测方法
靶蛋白检测方法：纤维蛋白原凝结活性测
定、精氨酸醋酶活力测定
杂质检测：SDS-PAGE
纤维蛋白原凝结活性测定
配制4mg/mL的纤维蛋白原溶液，将取
40 ul样品与200 uL纤维蛋白原溶液在37 ℃共
浴，5 min观察纤维蛋白原溶液是否出现白
色絮状凝结物，据此判断是否具有纤维蛋
白原凝结活性。
在体内不激活凝血因子XIII，并且由它水解
生成的纤维蛋白不产生侧链交联，对纤溶酶的消
化高度敏感，很容易被天然网状内皮系统或正常
的纤溶作用所清除，因此可导致胞浆中纤维蛋白
原浓度显著下降，表现降纤、抗凝的效果。 临床上，蛇毒类凝血酶已成为防治血栓栓塞 性疾病的有效药物。
技术路线
纯化
↓
纯度鉴定 ↓
表征
纯度鉴定 ↓ 表征
阳离子交换层析 (pH7.0) SP Sepharose XL ↓ 凝胶过滤层析(pH9.1) Sephadex G-25 ↓ 阴离子交换层析(pH9.1) MiniQ ↓ 凝胶过滤层析(pH 8.0) Superdex G-75
分子量 N端序列测定 酶最适温度 酶最适pH 酶动力学参数Km、Vmax 酶抑制剂分析
酶最适pH值表征
酶I和酶II的最适pH值均为8.0。
蛋白酶类型分析
将不同浓度的抑制剂(5 mmol/L PMSF ,
l10 mmol/L Benzamidine , 10 mmol/LDTT , 10
Βιβλιοθήκη Baidummol/L TPCK, 5 mmol/L EDTA)在20 mmo1/L
Tris-HCl (pH7.4)条件下，37℃温浴10 min，加
阳离子交换层析 (pH7.0) SP Sepharose XL ↓ 超滤浓缩 ↓ 凝胶过滤层析(pH7.9) Superdex G-75 ↓ 超滤脱盐并更换缓冲液 ↓ 阴离子交换层析(pH9.1) MiniQ 分子量 N端序列测定 酶最适温度 酶最适pH 酶抑制剂分析
改进
纯化
↓
SDS-PAGE PAGE
入2 ug酶，以BAEE为底物测其精氨酸酯酶活
力，以未加抑制剂的酶在相同条件下做空白
对照。
酶I和酶II的精氨酸酯酶活性都能被典型的丝氨酸 蛋白酶抑制剂PMSF和Benzamidine所抑制，而EDTA对 其没有任何影响，表明这两种酶均为丝氨酸蛋白酶。
技术路线总结
纯化
↓
SDS-PAGE
纯度鉴定
↓ 思考： 1、估算酶1和酶2的等 表征 电点范围。 2、本案例有哪些不足 之处？ 3、根据现有实验结果 如何改进实验方案？
通过疏水性相互作用进行中度纯化
摸索合适的疏水层析介质 建议使用的结合缓冲液：50 mM磷酸钠, pH 7 + 1.5 M 硫酸铵 建议使用的洗脱缓冲液：50 mM磷酸钠, pH 7
通过凝胶过滤色谱精细纯化
Superdex 75 prep grade 或者 Superdex 200 prep grade 建议使用的结合缓冲液：与后续使用的相符合
P2：目标蛋白I P4：目标蛋白I的抑制剂 P5：目标蛋白I的辅酶
2、以下是某研究生甲纯化 蛋白 A 的过程概述： 甲的最终目标，是要从植物的愈创组织中纯化蛋白 A。 当 收集得足够量的愈创组织后，加入适量缓冲液 (1 mM Tris-HCl, pH 7.0)，以研砵进行研磨，因为怕蛋白失去活性，尽快离心收集得 50 mL 上清，进行下一步骤。 很快加入 25 g 硫酸铵，使达到 50% 饱和度，得上凊约 40 mL；再加入 10 g 硫酸铵，使成为 75% 饱和 度，离心取沉淀。 溶解在 5 mL 缓冲液后，通入 DEAE-Sepharose 管柱中，据文献说蛋白 A 可被阴离子交换介质结合。 介质已平衡 在缓冲液，装填在 1.6 × 60 cm 的玻璃管柱。 样本通入后，以缓 冲液洗过数个管柱体积，开始拉 0-0.5 M NaCl 浓度梯度，并同时 收集。很奇怪，发现蛋白质几乎都损失光了，层析图谱也没有明 显的蛋白质尖峰。 只得重新抽取，再用硫酸铵沉淀后，改以凝胶 过滤法分离之，这次用 2.6 × 50 cm 管柱，使用 Sephadex G-50 介 质。 结果出现一个大的蛋白质峰，也有蛋白 A 活性，甚是高兴。 赶紧做 disc-PAGE 及 SDS-PAGE，结果发现介质过滤法前后的蛋 白质图谱，都差不多。 算一算总活性回收量，也不到文献报告的 十分之一。 请指出甲所犯的所有错误，并帮甲设计一个可行的纯 化流程。
粗毒 F-II
F-I
Buffer1：20 mM 磷酸缓冲液(pH7.0) Buffer2： Buffer1+0.5M NaCl
中度纯化
(2)凝胶过滤层析
将上一步有活性的组分超滤浓缩，用缓液
C (20 mmol/L Tris-HCI, 0.15 mol/L NaCI, pH 7.9)
平衡凝胶柱Superdex G-75，取2ml浓缩样品以
通过离子交换层析进行样品捕获
一 个 标 准 的 纯 化 步 骤
碱性蛋白：阳离子交换层析 建议使用的结合缓冲液：20 mM 磷酸钠, pH 7 建议使用的洗脱缓冲液： 结合缓冲液 + 0.5 M NaCl 酸性蛋白质：阴离子交换层析 建议使用的结合缓冲液: 50 mM Tris.HCl, pH 8 建议使用的洗脱缓冲液: 结合缓冲液 + 0.5 M NaCl
酶I因为样品量不够没有测序成功，而酶II测序成 功。所测得N端序列为：I IGGDECNINEHRFL。
酶II为新蛇毒类凝血酶，与这些类 凝血酶的N端序列具有较高的同源性。
酶最适温度表征
酶I的精氨酸酯酶活力在30℃时迅速上升，在70℃后迅速 下降。酶II的精氨酸醋酶活力在30℃时迅速上升，在60℃时迅 速下降。酶I的最适温度为60 ℃酶II的最适温度为50 ℃ 。
综合题分析
1、某蛋白质样本通入 DEAE-离子交换介质，以纯化 其中的 蛋白 I，样本中原含有 50 mg 蛋白质及 100 活 性单位蛋白 I。 以 0-0.3 M NaCl 梯度洗脱得数个 280 nm 尖峰，依次标以 P1, P2, P3, P4 及 P5，分别收集 之，分析均无任何 蛋白 I 活性。另外测得以下结果： a. 各蛋白质峰的蛋白质总量为 46 mg。 b. 当混合 P2 及 P5 后，可测得约 280 单位蛋白 I 活 性，其它的混合均无活性。 c. 当混合 P2, P4 及 P5 后，只测得 98 单位的蛋白 I 活性。 d. 测 P5 的蛋白质含量极低。 请问 P2, P4 及 P5 分别含有何种物质？
精氨酸酯酶活力测定
将BAEE（苯甲酰-L-精氨酸乙酯）用0.02
mol/L的Tris-HCl，pH7.4溶解配制成 8.5x104
mol/L的溶液，37 ℃恒温浴。取560 ul于石
英杯中，加入40 uL待测酶液，37 ℃测定其
在253nm处测定吸光度随时间的增加率。
粗提液制备
取0.3 g粗蛇毒，溶解在10 mL 20 mmo1/L 磷酸缓冲液(pH7.0)中，然后离心(10000 rpm,
2、以下是某研究生甲纯化 蛋白 A 的过程概述： 甲的最终目标，是要从植物的愈创组织中纯化蛋白 A。 当 收集得足够量的愈创组织后，加入适量缓冲液 (1 mM Tris-HCl, pH 7.0)，以研砵进行研磨，因为怕蛋白失去活性，尽快离心收集得 50 mL 上清，进行下一步骤。 很快加入 25 g 硫酸铵，使达到 50% 饱和度，得上凊约 40 mL；再加入 10 g 硫酸铵，使成为 75% 饱和 度，离心取沉淀。 溶解在 5 mL 缓冲液后，通入 DEAE-Sepharose 管柱中，据文献说蛋白 A 可被阴离子交换介质结合。 介质已平衡 在缓冲液，装填在 1.6 × 60 cm 的玻璃管柱。 样本通入后，以缓 冲液洗过数个管柱体积，开始拉 0-0.5 M NaCl 浓度梯度，并同时 收集。很奇怪，发现蛋白质几乎都损失光了，层析图谱也没有明 显的蛋白质尖峰。 只得重新抽取，再用硫酸铵沉淀后，改以凝胶 过滤法分离之，这次用 2.6 × 50 cm 管柱，使用 Sephadex G-50 介 质。 结果出现一个大的蛋白质峰，也有蛋白 A 活性，甚是高兴。 赶紧做 disc-PAGE 及 SDS-PAGE，结果发现介质过滤法前后的蛋 白质图谱，都差不多。 算一算总活性回收量，也不到文献报告的 十分之一。 请指出甲所犯的所有错误，并帮甲设计一个可行的纯 化流程。
改进：
当收集得足够量的愈创组织后，加入适量缓冲液 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)，低温匀浆，尽快离心收集得 50 mL 上清，进 行下一步骤。 低温下分次加入 15.7 g 硫酸铵，使达到 50% 饱 和度，静置2 h，离心取上凊；低温下再分次加入 8.8 g 硫酸铵， 使成为 75% 饱和度，离心取沉淀。 溶解在 5 mL 缓冲液后，先 用1.6 × 30 cm Sephadex G-25脱盐，收集蛋白峰，通入平衡好 的2.6 × 10 cm DEAE-Sepharose 管柱中， 样本通入后，以缓冲 液洗过数个管柱体积，开始拉 0-0.5 M NaCl 浓度梯度，并同时 收集。收集的组分做 disc-PAGE 及 SDS-PAGE分析。