实验__紫外-可见与分子荧光光谱

五．数据记录与结果分析
（一）有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应 1. 采用Origin软件绘制图1－图5，谱图上标注图号。用一张A4纸正反
两面打印5张图谱，附于实验报告中。
2. 在实验报告中，讨论与图号相对应的以下内容。 图1－图3：比较苯环上不同取代基对紫外吸收光谱的影响？试说明原因。 图4：比较n *跃迁随溶剂极性增大λmax如何改变？试说明原因。 图5：比较 *跃迁随溶剂极性增大λmax如何改变？试说明原因。
3. 在实验报告中，绘制标准曲线（图8），并虚线标出未知样 荧光强度及对应的浓度。
六．思考题 1. 当助色团或生色团与苯环相连时，紫外吸收光谱有那些变化？ 2． 当被测试液浓度太大或太小时，对紫外吸收光谱测量将产生 怎样影响，应如何加以调节？ 3. 同紫外吸收光谱法相比，为什么分子荧光光度法的灵敏度通常 更高？选择性也更好？ 4. 影响荧光定量分析准确性的因素有哪些？在分析过程中应该注 意哪些问题？ 5．结合本实验的目的和要求，请谈谈你对该实验的看法。 （如：你觉得该实验还有什么需要改进的地方？或者你觉得该实 验哪个部分的设计你最满意？请写出你的建议或意见，我们共同 提高！谢谢！）
σ→σ* 远紫外 n→σ* 紫外-可见 n→π* 紫外-可见 π→π* 远紫外-紫外
10 -200nm 200-250nm 200-400nm 150-700nm
摩尔吸光系数定义：物质对某波长的光的吸收能力的量度。指一定波长时，溶液的浓度为 1 mol/L，光程为 1cm时的吸光度值，用ε或EM表示。ε越大，表明该溶液吸收光的能力 越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。以一定波长的光通过时，所引起的吸光度值 A。
2．熟悉紫外－可见分光光度计和分子荧光的结构及特点， 掌握其操作使用方法。
3．掌握苯及其衍生物的紫外吸收光谱及其鉴定方法，以及 溶剂极性对紫外吸收光谱的影响。
1 紫外-可见光谱基本原理
电子从低能级跃迁到高能级，此时电子就吸收了相应 波长的光，这样产生的吸收光谱叫紫外光谱。
分子中电子能级跃迁的光波波长范 围为10～800nm 其中:
结构完全相同的化合物应有相同紫外谱图，但谱图相同的却不一定 是同种化合物。将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中， 在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两 者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标准谱图对 照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。
仪器结构 分析方法 荧光光谱法灵敏度高，信息大 紫外－可见分光光度法应用广泛
三. 仪器和试剂
仪器：UV-2450紫外－可见光谱 FluroMax-4分子荧光光谱
试剂：苯、苯酚、苯甲酸、环己烷、丁酮、异丙叉丙 酮、无水乙醇、蒸馏水；
硫酸奎宁
(C20H24N2O2)2·H2SO4·2H2O
四. 实验内容 （一）有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应
0.05ml 丁酮 / 蒸馏水 10ml
3ml
无水乙醇 3ml
3ml
蒸馏水 3ml
0.01ml 异丙叉丙酮/无水乙醇10ml 图5
0.01ml 异丙叉丙酮 / 蒸馏水10ml
3d / 无水乙醇 3ml
1d / 蒸馏水 3ml
无水乙醇 3ml 蒸馏水 3ml
（二）硫酸奎宁激发、发射光谱测定及标准曲线法定量分析
图谱
比色管
图1 0.05ml 苯 / 环己烷 10ml
图2 0.05g 苯酚 / 环己烷 10ml
图3 0.05g 苯甲酸 / 环己烷 10ml
样品比色皿 10d / 环己烷 3ml 2d / 环己烷 3ml
3d / 环己烷 3ml
参比比色皿 环己烷 3ml 环己烷 3ml
环己烷 3ml
0.05ml 丁酮 / 无水乙醇 10ml 图4
直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不 大。但是它们是测定紫外和可见吸收光谱的良好溶剂。
紫外光谱只能观察 π-π*和 n-π*跃迁。也就是说紫外光谱只适用 于分析分子中具有不饱和结构的化合物。能测试不饱和共轭双键的化 合物、芳香族化合物和过度金属离子。
根据吸收的波长，推断是什么价电子跃迁，从而判定分子结构骨架、 配合红外光谱法、核磁共振波谱法和质谱法等进行定性和结构分析， 它是一种有用的辅助手段。紫外吸收光谱虽然不能对一种化合物作出 准确鉴定，但对化合物中官能团和共轭体系的推测与确定却非常有效。
E带：苯环上三个 共扼双键 →* 跃迁特征吸收带
B带: → *与苯环共轭引起 230-270 nm =200
含取代基时，B带简化，红移。
紫外光谱的溶剂效应
溶剂效应：在不同溶剂中谱带产生的位移。受溶剂的极性 或酸碱性的影响，使溶质吸收峰的波长、强度以及形状发 生不同程度的变化
溶剂选择的原则： 1、不与被测组分发生化学反应 2、所选溶剂在测定波长范围内无明显吸收。 3、对被测组分有较好的溶解能力 4、被测组分在所选的溶剂中有较好的峰形
对于较浓的溶液，其吸光度超过0.05时，使荧光物质分 子之间以及荧光物质分子同溶剂分子之间的碰撞增加， 导致无辐射去活增加而发生自熄灭。
保证荧光分析线性的关键: 溶液尽量稀释 (吸光度小于0.05)
FLR Intensity
16 14 12 10
8 6 4 2
2
Ideal
Actual
4 6 8 10 12 14 C o n c e n tra tio n
4 装样 5 检测，软件使用
2 分子荧光光谱基本原理 荧光:电子从被激发到单基态S1跃迁到基态S0所发出的光
除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧光等
激发谱和发射谱
激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的 荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率； 发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的 分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。
10～190nm： 远紫外区--真空紫外区； 190～400nm：近紫外区，又称紫外光区； 400～800nm：可见光区。
*
n*
*
n*
n
*
*
E>
E >
E> E
(σ→σ*) (n→σ*) (л→л*) (n→л*)
远紫外
近紫外
饱和烃б键电子跃可迁见，它光需要的能量较高，一般发
生在真空紫外光区，饱和烃的最大吸收峰一般小于 150nm，已超出紫外、可见分光光度计的测量范 围。例如甲烷的λmax为 135nm。
激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关关系 吸收谱与发射谱呈镜象对称关系。
基态上的各振动能级分 布与第一激发态上的各 振动能级分布类似
荧光的定量分析
在稀溶液中，荧光强度F 与物质浓度c有以下关系：
F＝2.3Kφεb cI0＝2.3KφAI0，
当激发光强度一定，且浓度很小时，荧光强度与荧光物质浓度成 正比，即F=Kc。 这是荧光光谱法定量分析的依据。此关系只限于极稀溶液。
n→π有高﹡ 机，化比不吸摩烯合σ饱收尔(→蒸物杂和峰吸在随向中σ气中*原烃一光，不着长跃)的子的般系类共饱波迁πH不最处数和和轭方被→所饱大于大共系烃向杂需π和吸近，轭类统移*原的基收紫一体跃的分动子能团波外般系迁延子，取量，长光ε，产长代中吸少m这λ区它生后，收，，am类，需的x，强当吸a>π跃在要吸x实度有收1→迁2的收为0现也两光0π4发能带这0随个1谱*为生n量又6类之以跃的m2强在低称跃n增上迁波左吸近m于为迁的强的长右收紫。бK所双吸。一。-带带外б需般收键在其*。。光要的在共带共特如区的跃1将轭轭征乙和5能迁明时是体0量—，显系，较
荧光的浓度效应
荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。
原因可能是：
a 浓度增加，分子碰撞机会增加，增加了非辐射损 耗。
b 溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光） c 吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收） d 仪器原因
3 仪器结构
——紫外分光光度计;
―――荧光分光光度计
荧光光谱法与紫外－可见分光光度法的比较
极性溶剂中紫外吸收光谱的精细结构完全消失
* 跃迁，溶剂极性增加，吸收红移。 n* 跃迁，溶剂极性增加，吸收蓝移。
*
* 跃迁
En
*
Ep
非极性溶剂 极性溶剂
*
n* 跃迁
En
*
n
Ep
n
非极性溶剂 极性溶剂
л-л*: 基态的极性小于激发态的极性，极性溶剂与激发态间相互作用
(稳定作用)大于基态,导致极性溶剂中△Ep 降低, λmax向长波方向移动。
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紫外光谱图及表示方法
15
12
或 lg 9 或A 6
3
200 220 260 280
nm
320 340
横坐标：波长λ （nm）
纵坐标：A, T , 1-T, , log,
核心三要素：吸收峰位置 吸收强度 形状
苯及苯环上不同取代基对紫外光谱的影响
苯：
E1带:180184nm =47000 E2带:200204 nm =7000
实验 紫外-可见光谱
西安工业大学
2012.04
目录
一 实验目的 二 实验原理
1 紫外-可见光谱基本原理 2 仪器结构 三 仪器和试剂 四 实验内容 1 有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应 五 数据记录与结果分析 六 思考题
一 实验目的
1 掌握紫外－可见分光光度法和分子荧光的分析原理，了 解两者的区别与联系
寻找硫酸奎宁的激发光谱（图6）和发射光谱（图7），找到最大 激发波长λex和最大发射波长λem
标准曲线的绘制： 以最大激发波长λex为激发波长，测量系列 标准溶液荧光强度。以溶液荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度 为横坐标，制作标准曲线（图 8）。
未知样测定：将未知样与标准系列溶液同样条件，测定荧光 强度，在标准曲线上找出对应浓度。
n-л*: 非成键n电子与极性溶剂相互作用形成氢键,极性溶剂与基态间
相互作用(稳定作用)大于激发态态降低了基态的,导致极性溶剂中 △Ep>△En,λmax向短波方向移动
溶剂效应对丙酮紫外吸收的影响 1-己烷 2-95%乙醇 3-水
1 预热 2 准备样品 3 比色皿：先用少量蒸馏水洗涤3次，再用参 比液洗 涤3次，擦拭比色皿外部
250nm处。其可吸见收光光区谱，落其于特远点紫是外谱光带区强和度近弱紫，外摩光尔区吸，光例系如，
CH3Cl、CH3数Br小和，C通H3常I的小n于→10σ0*，跃属迁于分禁别阻出跃现迁在。173、204和
258nm处。这些数据说明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相应的
收波长发生了红移，显示了助色团的助色作用
（二）硫酸奎宁激发、发射光谱测定及标准曲线法定量分析
1. 采用Origin软件绘制图6、图7，谱图上标注图号。用一张A4纸打印 2张图谱，附于实验报告中。
2. 在实验报告中，记录硫酸奎宁系列标准溶液和未知样品的荧光强 度如下：
溶液名称
溶液浓度 μg/mL 荧光强度
溶液1
溶液2 溶液3
溶液4 溶液5 溶液6 未知溶液