EPA方法531.1

方法531.1 直接进样柱后衍生高效液相色谱法测定水中的N-甲基氨基甲酰胺和N-甲基氨基甲酸酯
1.0 适用范围及应用
1.1这是一种用高效液相色谱来测定地下水和饮用水中的某些N-甲基氨基甲酰胺和N-甲基氨基甲酸酯的方法。

以下化合物可以用这种方法进行测定：
1.2 该方法已经在单一实验室经过验证，估计检出限(EDLs)和方法检出限(MDLS)通过对以上分析物的测定确定。

观察到的检出限可能会改变，这取决于地下水样品中基质干扰和具体使用的仪器。

1.3 该方法仅限于对具有使用液相色谱法和分析液相色谱图经验的分析师使用或在其监管下使用。

每个分析师必须证明自己有能力按照9.3节描述的实验过程得到可接受的结果。

1.4 当使用这种方法来分析不熟悉水样中的以上任一或全部分析物时，至少使用一种附加的定性方法来识别分析物。

2.0 方法概述
2.1 水样过滤之后取400μL注射到反相高效液相色谱柱。

通过梯度淋洗色谱法来完成分析物的分离。

从高效液相色谱柱洗脱后，用0.05mol/L的氢氧化钠在95摄氏度的温度下水解分析物。

水解过程中形成的甲胺与邻苯二甲醛和2-巯基乙醇反应生成一种高度荧光衍生物，这种物质可以通过荧光检测器检测。

分析物通过程序标准校准来进行量化校准(
3.14节)。

3.0 定义
3.1 内标物：将一种已知质量的纯的分析物加入到待测溶液中，用来测量组成同
一溶液的分析物和替代品的相对响应。

内标物必须是一个分析样品而不是一个样品的组成部分。

3.2 替代物：一种在样品中很难找到的纯净物，在提取之前加入已知质量的这种物质到样品中，用相同的程序进行测量。

3.3 重复性实验(LD1和LD2)：在分析实验室中，取两个等量的样品，在相同的条件下分离分析。

LD1和LD2的分析中给出了相关的精密测量实验步骤。

但没有给出样品采集，保存，或存储步骤。

3.4现场重复(FD1和FD2)：在同一时间和相同环境下, 通过现场到实验室的处理过程进行2个分离样品的收集。

FD1和FD2的分析中给出了相关的样品收集，保存，储存的精确方法以及实验步骤。

3.5实验空白试剂(LRB)：等量分配的试剂水可以作为一个样品，这个样品可以是接触的玻璃容器，设备，溶剂，试剂，内标物，和被用于其他样品的代替品。

空白试剂是用于判定在实验环境，试剂，仪器中是否存在方法分析物和其他干扰。

3.6现场空白试剂(FRB)：在实验室，试剂水放在样品容器中，作为一个样品处理应用在各方面中，其包括接触采样点的条件，贮藏，保鲜和所有的分析方法。

使用现场空白试剂的目的是判定在现场环境下，是否存在方法分析物或其他干扰。

3.7实验室性能检查溶液(LPC)：方法分析物，替代化合物, 以及用来评估方面的标准定义的方法，设置该仪器系统性能的内部标准的溶液。

3.8加标空白实验(LFB)：在实验室中将等量分配的试剂水加入相当数量的方法分析物中。

使用LFB方法对样品的准确分析，其目的是判定是否操作能够控制，是否在实验进行中能够在所规定的检测限范围得出准确和精确的实验数据。

3.9样品加标实验(LFM)：在实验中，将等量分配的环境样品基质添加到相当数量的方法分析物中。

使用LFM方法对样品的准确分析，其目的是判定是否样品基质对分析结果产生误差。

在样品基质的分析样品背景浓度应在单独的等量分配样品中测定和在使用LFM方法时应对测量值背景浓度修正。

3.10 标准储存溶液(SSS)：浓缩液包括的单一的认证标准，这标准是一种方法分析物，或是在实验中单一分析物制备所需要分析的参考化合物。

标准储备溶液用于配制初始的稀释标准。

3.11 初级稀释标准溶液(PDS)：实验室配制的几种分析物的标准溶液，稀释到配制校准溶液和其他分析物需要的浓度。

3.12 校准标准(CAL)：由初始稀释标准和内部标准和替代分析物的标准储存所制定的解决方案。

CAL解决方案用于对校准反应器的反应物的浓度。

3.13样品的质量控制(QCS)：样品基质包括方法分析物和用于强化试剂或者是环境样品的与水溶液互溶的溶剂的方法分析物。

质量控制是从一个与实验室无关的
来源获得，用额外准备好的实验材料来检查实验室的性能。

3.14 程序标准校准：水的标准校准已经准备之后，程序(如净化，提取)也用同样的方式校准。

4.0 干扰
4.1方法的干扰可能是由于溶剂、试剂、玻璃器皿污染物和来样加工等硬件，导致分散物质或液体色谱基线升高。

具体的污染源还没证实。

这些材料都必须根据分析条件通过运用实验室试剂空白摆脱干扰，像9.2节所述空白的分析条件的去除干扰。

4.1.1玻璃器皿必须严格清理。

尽快用他最后使用了的溶剂冲洗玻璃器皿。

溶剂冲洗应遵循用热水和清洁剂洗涤,用自来水和蒸馏水冲洗。

沥干水分，并在看、烘箱马弗炉中在400 度下干燥1个小时。

不能对容积器进行加热。

热稳定材料这样处理可能无法去除。

用丙酮冲洗可以替代加热。

经过干燥和冷却后玻璃仪器应密封,并保存在一个干净的环境中,为防止灰尘积累或其他污染物，应倒置储存或用铝箔盖住。

4.1.2使用高纯度的试剂和溶剂可以使干扰问题最小化。

溶剂的蒸馏净化被要求在全玻璃体制中进行。

注意：净化溶剂时，稳定剂制造商将被拆下，从而可能使溶剂有危险。

此外，溶剂净化时，防腐剂制造商将被拆下，从而潜在地减少了保质期。

4.2 测定完一个相对浓度较低的分析物后立即测定一个相对浓度较高的分析物可能会发生污染干扰。

在测两组样之间可以用蒸馏水冲洗样品注射器和滤光片夹来预防干扰。

分析完一个含高浓度分析物的样品之后，要做一个或多个空白分析。

4.3基质干扰可能会由从试样中同步提取的污染物引起。

基质干扰的程度会因来源的不同而大不相同，这取决于水样。

分析物必须被确认，可以选择一种化学或物理原理的检查器，如质谱，或使用第二个色谱柱。

5.0 安全
5.1在该方法中用到的试剂的毒性和致癌性都还未得到精确的认定；然而，每一种化学化合物都应该被认为有潜在的危害来对待。

从这种观点来看，无论用什么一切可能的手段，都应该使这些化合物减小到可能的最低水平。

实验室对职业卫生与安全管理局指定的危险化合物都保持着最新的关注，以达到对实验操作中的安全负责。

一个包括化合物分析在内的操作数据表的相关文件应该对实验室的全体人员开放。

实验室增加的可能的安全干扰因素已经由分析员鉴定。

注意：净化溶剂时，稳定剂制造商将被拆下，从而可能使溶剂有危险。

6.0 仪器和材料
6.1 取样设备
6.1.1 随机采样瓶—60mL的螺帽瓶，聚四氟乙烯硅胶盖，使用前，参照4.1.1节清洗瓶子和隔膜。

6.2 分析天平，精确度达0.0001g
6.3 过滤设备
6.3.1大型过滤装置过滤HPLC用流动相和衍生溶液。

推荐使用47mm的过滤器。

6.3.2微型过滤装置HPLC进样分析前需过滤。

使用13mm的过滤器和13mm直径0.2μm聚酯过滤器。

6.4 注射器和注射器阀门
6.6 高效液相色谱仪
6.6.1 高效液相色谱能注射200-400μL溶液，以恒定流速二元线性梯度洗脱。

数据系统推荐测定峰面积。

方法分析得到的保留时间在表1列出，分析的柱子和分析条件在下面描述。

6.6.2 柱1(主柱)：150mm×3.9mm，碳18柱，不锈钢筛板孔径4μm。

流动相为甲醇：水为10:90，保持2分钟，然后以甲醇：水为80:20线性梯度运行。

如遇到9.4节所描述的情况就可以用替代柱。

6.6.3 柱2(替代柱)：250mm×4.6mm，Beckman碳18柱，不锈钢筛板孔径5μm。

流动相流速为1.0 mL/min，线性梯度在32分钟之内由甲醇：水为15:85变为100%甲醇。

方法使用此柱子也可以提供数据。

更新的柱子仍然不能解决涕灭威，氨苯砜，杀线威的问题。

6.6.4 柱3(替代柱)：250mm×4.6mm，Supelco LC-1色谱柱，不锈钢筛板孔径5μm。

流动相流速为1.0 mL/min，线性梯度在32分钟之内由甲醇：水为15:85变为100%甲醇。

6.6.5 柱后反应器：将试剂混合入流动相。

反应器应装聚四氟乙烯管子和使以流速在0.1-1.0 mL/min传输每种试剂的泵。

三通混合，两个1mL的延迟线圈，一个95摄氏度的恒温器。

6.6.6 荧光检测器：激发波长330nm，发射波长大于418nm。

本实验中选择Schoeffel Model 970荧光检测器，效果较好，数据可用。

7.0 试剂和标准
8.1 定时采样的样品必须用玻璃容器采集。

应遵循常规的采样方法；但是，容器在采样前不需要用样品进行预冲洗。

8.2 样品保存/调整pH：杀线威、三羟基克百威、涕灭威亚砜、西维因能在室温下能很快在中性的水中降解。

短期的降解与时间样品运输和时间程序样品在室温下自动进样盘进样有关。

这三种分析样品都要在pH为3的条件下保存。

调整pH 值还可以减小分析物的生物降解。

8.2.1 在60mL样品瓶中加入1.8mL一氯醋酸缓冲液。

在采样地或在去采样之前的实验室就在样品瓶里加好缓冲液。

8.2.2 如果存在残留的氯，在采样之前每升样品加80mg硫代硫酸钠。

8.2.3 样品采集到盛有缓冲液的采样瓶后，密封瓶子，然后剧烈摇动一分钟。

8.2.4 样品采集回来必须在4摄氏度冷冻或冷藏。

尽管样品在pH为3或更低条件和运输保存在4摄氏度环境下保存28天的结果表明水样中的分析物并没有不稳定，但分析物的不稳定性可能受到基质的影响。

因此，分析师要检验所用的保存技术是否适用于要研究的样品。

9.0 质量控制
9.1 最低质量控制要求是实验室性能最初的证明，监测每一个样品和空白中内标物的峰面积或峰高(在内标物校准程序正在使用的时候)，分析实验室空白试剂，实验室加标样本，实验室加标空白样本和质控样本。

9.2 实验室空白试剂：进行任何样品处理之前，分析师必须保证所有的玻璃仪器和试剂的干扰处于控制之下。

每次在一组样品提取或试剂变化后，都必须测一个空白值。

如果在分析保留时间窗口影响中，LRB产生一个峰,那将会影响测定结果,因此在测定样品之前,要查找对污染源,并对其消除。

9.3 性能的最初证明
9.3.1 选择一个具有代表性的浓度，大约是10倍估计检出限(EDL)，或者是每种分析物校准标准中的一个中间浓度。

配制包含可选择的每个分析物的浓度在1000倍的初级稀释标准溶液(用甲醇配制)。

用注射器加50μL浓缩液到每4-7个50mL的试剂水中，用11.0节所述程序分析。

9.3.2 所有样品的的回收率在80%-120%之间，RSD不大于20%。

对于那些符合验收标准的化合物，取样分析判断被接受的才能开始分析。

对于那些不符合标准的化合物，这个程序必须用4个样品重复试验知道得到满意的证明为止。

9.3.3 分析至少7个低浓度的加标空白样品确定方法检出限。

参照表3的浓度或使用校准数据估计在信噪比为5的条件下会出峰的浓度。

用11.0节描述的方法分析7个重复样品，按照日程安排，几天之后会得到分析结果。

计算每种分析物的平均精度和标准偏差。

用表3给出的方程式计算方法检出限。

9.3.4 最初性能证明主要用于排除在获得一些经验之前用新的，不熟悉的方法分析未知样品。

作为实验人员期望用这种方法获得的经验可以提高实验数据的质量。

9.4 分析师可以调整高效液相色谱柱、色谱条件和内标物来提高分离或降低分析成本。

每调整一次方法，分析师必须重复9.3节所述过程。

9.5 评价内标物
9.5.1 用内标物校准程序时，分析师必须监控每天分析的所有样品中内标物响应(峰面积或峰高)。

任何样品色谱的内标物响应都不应该偏离日常校准检查的内标物响应的30%以上。

9.5.2 如果个别的样品偏差大于30%，优化仪器性能并注入第二小分样品。

9.5.2.1 如果重新注入的样品产生可接受的内标物响应，报告结果就用这个样品的数据。

9.5.2.2 如果偏差仍大于30%，样品的分析需从11.0节开始重复做，提供一个重复样品仍然是可行的。

否则，报告结果从重新注入的样品获得，但是结果是令人怀疑的。

9.5.3 如果连续样品不符合内标物响应接受标准，立即分析一个校准检查标准。

9.5.3.1 如果检查标准提供的内标物响应在预测值的20%之内，将内标物校准失败的样品按9.5.3节叙述的程序做。

9.5.3.2 如果检查标准提供的内标物响应超过预测值的20%，分析员必要按10.0节叙述的重新校准。

9.6 评估实验室性能-加标空白实验
9.6.1 每分析20个样或一组样品至少分析一个空白样品(所有样品分析以24小时为周期)。

在加标空白实验中每个分析物应该为10倍估计检出限(EDL)的浓度或者为校准实验范围中的一个浓度，以较高者为准。

计算准确的回收率(Xi)。

如果任何一种分析物的回收率超出控制限(见9.6.2节)，分析物被判定为失去控制，在继续分析之前必须找出问题的根源和解决问题。

9.6.2 直到从他们自己的实验室得到足够的数据变成可用的数据，通常是20-30个分析物中一个最小的结果，实验室应该根据控制限评估实验室的性能(9.3.2节)。

当足够的内部性能数据变成可用的，通过平均回收率(X)和回收率的标准偏差(S)得到控制限。

这些数据是用来建立最高和最低控制限，公式如下：
最高控制限=X+3S
最低控制限=X-3S
每5-10个回收率测定之后，用最近测得的20-30个点的数据重新计算新的控制限。

计算出来的控制限不应该超过9.3.2节所叙述的范围。

9.6.3 如果不能取得可接受的精确度和方法检测限，在进行进一步样品分析之前必须找出并校正这个问题。

从最后一个可接受的加标空白实验后的所有现场样品分析数据应该考虑是否可信，还需要分析平行样品，如果结果可接受，则问题几经被校正。

加标空白实验的结果应被加到持续的控制图来证明数据的质量。

由于在10.2.4节和10.3.3节叙述的样品校正检查和加标空白实验都使用同一种方法和程序标准，这里的样品分析也可以用来像那些节描述的那样做校准检查。

9.6.4 建议实验室定期地确定和证明其分析物质的检测限能力。

9.6.5 至少每季度分析一个外部来源的质控样品。

9.7 评估分析物的回收-加标样品基质实验
9.7.1 实验室必须加一个已知浓度的溶液到至少5%的常规样品或每组一个样品，以较高者为准。

浓度不应小于选择用来加标的样品的背景浓度。

理想的浓度是与加标空白实验(9.6节)所用浓度相同。

随着时间的推移，所有样品都需要做加标回收实验。

9.7.2 计算加标回收率,P-经过分析结果校正之后的每种分析物的浓度，X-加标样品的背景浓度，b-从未加标的样品测得，也就是：P=100(X-b)/加标浓度，将这些值与控制限比较，适用于用同一方式收集的试剂水数据。

P的值应该在加标量的65-135%的范围内。

9.7.3 如果任何一种分析物的回收率超出特定的范围，对那种分析物的实验室性能就在控制之下(9.6节)，剂量样品的回收率问题被判定为与基质有关，与方法无关。

那种分析物的未加标样品的分析结果也被认为是可疑的/结果不可信的原因是基质效应。

9.8 评估仪表系统-实验室性能检查样品
通过每天分析实验室性能检查样品来检测仪器性能。

实验室性能检查样品包含的化合物是为了检测仪器的灵敏度，柱的性能和色谱性能。

实验室性能检查样品的成分和性能标准在表4中列出。

无法证明仪器性能的可接受性意味着需要重新评价仪器系统。

灵敏度按照发表在这个方法的估计检出限来设置。

如果实验室估计检出限与那些列在方法中的不同，实验性能检查标准溶液的化合物的浓度必须调整到与实验室估计检出限一致。

9.9 实验室用这种方法还可以采取额外的质量控制措施。

具体的措施大部分根据实验室的需要和样品的性质来决定。

比如，现场和实验室副本可以分析评估环境测量的精度，或现场空白样品试验用来评估在现场条件，运输和储存条件下的污染情况。

10.0 校准和标准化
10.1 高效液相色谱的操作参数在6.6节说明。

高效液相色谱的校准可用内标法(10.2节)或外标法(10.3节)。

10.2 内标法校准过程：分析师必须选择一个或多个分析性能类似的内标物来分析。

分析师必须进一步证明内标物测量不受方法或基质干扰影响。

BDMC(4-溴-3,5-二甲基氨基甲酸酯)已经被确认为一个合适的内标物。

10.2.1 每种分析物至少配制3个浓度梯度(推荐为5个)的校准用标准，加一个或多个储备标准到容量瓶。

指导的若干标准如下：至少需要3个校准用标准来校准
浓度中的20个因素。

若为50个因素用至少4个标准，100个因素至少用5个标准。

最低浓度的标准应该近似代表分析物浓度，但是以上是他们各自的方法检出限。

剩下的标准应排除样品预期分析物浓度，或者应定义检测器的工作范围。

对每一个校准用标准，加入已知恒定数量的一个或多个内标物，然后用缓冲液稀释。

配制缓冲溶液，加10mL1.0mol/L的一氯醋酸缓冲液到1L试剂水中。

10.2.2 按11.0节叙述的程序分析每一个校准用标准。

把每一种化合物和内标物的峰面积或峰高对浓度制成表格。

用下面的方程计算每种分析物和替代物的响应因子。

式中：As为被测分析物的响应值
Ais为内标物响应值
Cis为内标物浓度μg/L
Cs为被测分析物浓度μg/L
10.2.3 如果响应因子值在工作范围内是恒定的(RSD≤20%),则平均响应因子值可以于计算。

另外结果可以用来绘制响应率的校准曲线。

10.2.4 工作的响应因子或者校准曲线必须每个工作日验证，测定至少2个校正检查标准，一次在分析日的开始，一次在结束的时候。

这些检查标准应该在两个不同的浓度梯度来见证浓度曲线。

因为长时间的分析(超过8小时)，强烈建议在样品分析过程中定时穿插检查标准的测定。

如果任何分析物的响应值与预期的响应值不同，变化超过±20%，必须用新鲜的校准用标准来重新测定。

如果解说任然不一致，重新做校准曲线。

10.3 外标法校准过程
10.3.1 按10.2.1节所述配制校准用标准，省略内标物的使用。

10.3.2 按11.2节所述从最低浓度开始分析每个校准用标准，将响应值(峰高或峰面积)对标准浓度制成表格。

其结果可以来准备每个化合物的校准曲线。

另外，如果响应值对浓度(校正因子)的比例在工作范围内是恒定的(RSD≤20%),原始的线性可以计算出来，平均比例或校正因子可以代替校准曲线。

10.3.3工作的响应因子或者校准曲线必须每个工作日验证，参照10.2.4节。

10.4 定期验证校准曲线，推荐至少一个季度一次，测定从独立源得到的标准物配制的标准。

这些分析得到的结果必须在日常检查标准限之内。

11.0 过程
11.1 调整pH和过滤
11.1.1 在每一个样品(加标空白实验，空白实验或校准用标准)中加入防腐剂，不
是预先保藏的(8.0节)。

在每50mL样品中加1.5 mL2.5mol/L的一氯醋酸缓冲液来调整样品或标准的pH为3±0.2。

如果采集样品时已经调节pH值作为保存措施，这一步就不是必要的。

装入50mL容量瓶并贴标签。

加5μL内标物加标溶液(在内标校准程序运行是)，反复倒置容量瓶使混合均匀。

11.1.2 将一个三通阀粘在10mL的注射器上。

把干净的滤膜置入过滤器夹，将过滤器夹和7-10cm的注射针头黏在注射前阀门上。

用试剂水冲洗针头和注射器。

用5mL试剂水预湿滤膜。

排空注射器，检查是否泄漏。

用注射器吸10mL样品，注射通过滤膜。

再吸10mL样品，注射通过滤膜，收集最后的5mL用来分析。

用试剂水冲洗注射器，丢掉滤膜。

11.2 液相色谱法
11.2.1 6.6节总结了推荐的液相色谱运行条件。

表1列出了用这种方法测量的保留时间。

如遇到在9.0节讲到的需求，可以选择另外的高效液相色谱柱或色谱条件。

11.2.2 按10.0节所述校准或验证系统日常校准。

标准和样品必须在pH为3的缓冲液中。

11.2.3 注入40μL样品。

记录注入样品的体积和由此产生的峰的大小。

11.2.4 如果响应的峰值超出系统的工作范围，用pH为3的缓冲液稀释之后重新分析。

11.3 分析物的鉴定
11.3.1 比较保留时间与参考色谱图的保留时间来确定样品成分。

如果一种未知化合物的保留时间在一定范围内与标准化合物的保留时间一致，就可以认为存在这种物质。

11.3.2保留时间范围的确定应该基于标准在一天内保留时间测量的差异。

三次测量中标品的保留时间偏差可用来计算一个化合物的保留时间。

然而在色谱图的解析上分析师得经验很重要。

11.3.3当样品组分不能通过色谱分离法确定时就需要更专业的判断。

当峰值明显地代表不止一个样品组分时(比如峰太宽，有两个或多个峰)，或在怀疑是否存在色谱峰的时候，适当的转换技术，来帮助确定峰值。

例如，替代检测器的使用，不同于质谱的利用物理化学原理的方法，或者用第二根色谱柱。

在6.6.3节已经叙述了替代柱的建议使用方法。

12.0 计算
用如下方程计算样品中单个化合物的浓度：
式中：Cx为分析物浓度μg/L
Ax为样品分析物的响应值
As为标准的响应值(内标或外标)，与分析物响应值的单位一致
RF为响应因子(有外标物的，RF=1，因为标准与被测分析物的是相同的化合物；有内标物的，RF无单位值)
Qs为外标物或内标物浓度μg/L
用10.0节讲述的方法进行多点式校准。

不能使用日常校正验证数据来定量样品中的分析物。

13.0 方法性能
13.1 在单一实验室，分析物回收率用来确定分析物的方法检出限和估计检出限以及证明方法的使用范围。

分析物某一浓度的回收率和回收率标准偏差在表3中列出。

13.2 在单一实验室，地下水中两种合成标准的回收率要在同一浓度级别测定。

实验结果用来证明该方法对不同地下水基质的适用性。

两种混合基质的回收率在表2中列出。