细胞工程学 第4章

第四节
培养细胞生物学性状检测
细胞在体外培养过程中，包括 原代培养或传代培养时，一是要逐 日进行常规检查，观察细胞有否污 染、细胞生长状态、培养液是否需 要更新和调整等。
一、细胞培养常规检查
在细胞接种或传代后生存期间，实验 者需每天或至多间隔1～2天，对细胞做常 规性检查。 观察的内容： 1、污染与否、细胞生长和pH变化等情况。 2、随时掌握细胞动态变化，以确定是否需 要做换液或传代处理。
三、细胞培养的污染及控制 污染是细胞培养的大敌。预 防和避免污染是细胞培养成功的 关键之一。
(一) 细胞微生物污染的类型
1. 2. 3. 4. 5. 细菌污染 真菌污染 支原体污染 病毒污染 非同种细胞污染
（二） 污染来源及鉴别
1.污染来源 （1）不洁的动物组织标本 （2）空气 （3）清洗消毒 （4）操作 2. 污染的鉴别 （1）细菌、真菌污染的检测 （2）支原体污染的检测
(1)中性红染色 (2)结晶紫染色 (3)台盼蓝染色
4、固定细胞观察法
组织培养既可直接观察活细胞， 也可进行固定制成永久标本观察。 标本制好以后可以长期保存和做长 时间的观察、分析。
5、固定细胞染色观察法
培养细胞染色有一般和特殊之分；一 般染色为观察细胞一般形态之用，特殊染 色为用于观察细胞特殊成分的染色方法。
（2）细胞冻存液的配方有很多种： 培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1： 1或5：4：1。冻存细胞时也可直接 用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血 清有助于维护细胞活力，对原代培 养的细胞，以90%血清冻存更为有效， 复苏存活率在80%～90%以上。
（3）细胞冻存在液氮中可以长期保 存，但为妥善起见，冻存半年后， 最好取出一支冻存细胞复苏培养， 观察生长情况，然后再继续冻存。 细胞在液氮中可长期冻存无限时间， 而不会影响细胞活力； 注：在-80度只可保存数月
常用染色法：
(1)Giemsa染色法 (2)苏木精-伊红（H.E.）染色法 (3)Feulgen染色法 (DNA特异性染色) (4)吖啶橙染色荧光观wk.baidu.com法
第二节
电子显微镜观察法
电 子 显 微 镜
一、透射电镜细胞样品制备技术和 观察方法
超薄切片制作样品过程大体分为 取材、固定、脱水、渗透、包埋、修 块、切片、电子染色等步骤。
1.细胞计数
用细胞计数法测定细胞生长动力学 是目前采用的最普遍的方法。 计数方法：
血细胞计数板人工计数 细胞计数器
4×稀释倍数 计数平均值×10
=细胞数/ml
计数中，如果细胞悬液的细胞浓度 过高，必须稀释后再计；如果细胞数太 少，可离心浓缩后再计。每个细胞悬液 至少滴样两次求平均值。
2.生长周期、细胞周期的检测
任何一个细胞系在接种培养过程中均经 过生长缓慢期、快速生长和最后维持稳定期 的生长周期。掌握一个细胞系的生长周期， 必须严格控制取样、培养时间等培养条件。
细胞周期
有丝分裂
细胞系生长周期曲线
• DT：倍增时间（doubling time）
流式细胞仪检测细胞周期时相和DNA合成 近年来流式细胞仪的发展已成为 检测细胞增殖周期的主要手段，可进 行多项检测，如细胞周期时相、DNA合 成强度、持续时间等，已取代了应用 同位素等繁琐方法。特别是培养细胞 非常适用于做流式细胞仪检测的对象， 且程序简单、快速、效果准确。
（一）形态学方面
主要观察： （1）细胞类型归属，确证为上皮型或 为成纤维细胞型等； （2）细胞的一般形状大小、核浆比例、 染色质和核仁大小及多少等。
（二）细胞增殖生长方面
细胞增殖生长率是判定细胞活力的 重要指标，有多种显示方法。 常用方法：
1.细胞计数 2.生长周期的检测 3.有丝分裂指数的计算 4.细胞周期测定 5.生长晕的测量
（三） 污染的清除和预防
1.污染的清除 （1）使用抗生素 （2）加温处理 2. 污染的预防 （1）从物品、用品消毒灭菌着手 （2）从操作者做起 （3）防止细胞交叉污染
第五节
细胞的冻存与复苏技术
一、细胞的冻存
细胞在不加任何保护剂的情况下直接 冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶， 从而导致细胞死亡。采用甘油或二甲基亚 砜(DMSO)作保护剂，这两种物质分子量小， 溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降， 提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明 显毒性。
透射电镜
效 果
细胞膜的电镜观察
细胞核和高尔基复合体的电镜观察
二、扫描电镜细胞样品制备 扫描电镜细胞样品的制备包 括取材、固定、脱水、干燥、样 品导电处理等。
扫描电镜效果
乳腺癌细胞
美国黑核桃树叶下表面
第三节
免疫细胞化学技术观察法
一、标本制备及固定
1．标本制备 细胞可直接培养在盖玻片 上、培养瓶内或培养板上，也 可将一定量的细胞收集离心制 成涂片。
二、 细胞的复苏
1、细胞复苏的方法
（1）自液氮中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧， 由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 （2）将取出的冷冻管，立即放入37℃水浴中快 速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化， 以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台 内。 （3）将解冻的细胞悬浮液取出移入含有5-10ml 培养基的离心管内，吹打均匀，离心5分钟。 （4）移去上清液，加入新鲜培养基吹打均匀， 放入培养瓶中臵CO2培养箱培养。
第四章
培养细胞性状的 检测、保存与鉴定
第一节
培养细胞的一般 形态学观察法
细胞在体外培养过程中需要每 天进行常规检查和显微镜观察，及 时了解细胞生长状态、数量改变、 细胞形态、细胞有无移动、有无污 染、培养液的pH是否变酸、变黄是 否需要更换等。
细胞常规检查观察的内容为：
1、肉眼观察 2、显微镜观察 3、离体活细胞染色观察
二、一般细胞系的鉴定及其特征
（1）首先确定细胞系的细胞来源，是 上皮样细胞还是成纤维样细胞来源； （2）鉴定细胞系的纯度，即除主类细 胞外，还杂有哪类细胞，在细胞系中 所占比例多少；
（3）细胞系的稳定性，细胞系是否稳定， 决定其能否被采用来作为实验材料； （4）累积细胞系的形态及其表达特征的基 本数据，以及其与来源细胞的差异； （5）比较各细胞系间的同与异。掌握了细 胞系的特性后，则可提高以该细胞系为材 料所得的实验结果和推论的准确性。
2、注意事项
在细胞复苏操作时，应注意融化冻 存细胞速度要快，可不时摇动冷冻管， 使之尽快通过最易受损的温度段（-5～ 0℃）。以保证细胞外结晶快速融化， 避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形 成胞内结晶损伤细胞。这样复苏的冻存 细胞存活率高，生长及形态良好。
3.生长晕的测量
外植块外周形成薄而透明的生长 晕时，表明培养物生长正常；取生长 良好的培养物观察其生长情况。从起 始培养后间隔一定时间，如培养24小 时和48小时，在显微镜下借用投影描 画仪将组织块大小和生长晕外周轮廓 画在同一张纸上。
成纤维母细胞生长晕绘图
• 中央E为接种培 养的外植块面积；A 为培养6小时时的生 长晕面积；B为培养 12小时后的生长晕面 积；C为培养24小时 时的生长晕面积。
（3）将冷冻管盖子盖紧，并标记好细胞名 称和冻存日期，同时作好登记（日期、 细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将冻存管臵入4℃冰箱中30分钟，再 移至－20℃冰箱30分钟，－70℃冰箱2小 时或过夜，最后放入液氮罐内。
2、注意事项
（1）要定期给液氮灌充液氮，以确 保液氮灌内有一定量的液氮。液氮温 度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅 到皮肤上，以免引起冻伤。
慢速冷冻方法又可使细胞 内的水分渗出细胞外，减少胞 内形成冰结晶的机会，从而减 少冰晶对细胞的损伤。
1、细胞冻存方法
（1）选择处于对数生长期的细胞，去细胞 培养液，PBS清洗，0.25% 胰蛋白酶消化。 将细胞收集于离心管中离心。离心后弃 上清液，加含血清的培养基重悬细胞。 （2）取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻 前存活率。细胞浓度为1～10×106/mL之 间。加入冻存管，约1ml/管。
2、免疫酶标技术
是最常用的免疫细胞化学技术。 它把抗原抗体的免疫反应和酶的高效 催化作用有效地结合起来。 本技术有免疫荧光的优点，又克 服了它们的缺点。
免疫酶组织化学方法和免疫荧 光方法相比较，具有下列优点：
（1）用普通的光学显微镜即可检测，易于 推广；而且能用于超微结构的研究。 （2）对比度好，且染色后可长期保存； （3）可用苏木精等试剂复染，可将免疫组 化染色结果与形态学特征相结合进行分析。
2．固定
（1）10%福尔马林 （2）丙酮 （3）4%多聚甲醛 固定时间：酒精、丙酮5～15分钟 多聚甲醛3～5分钟 福尔马林10～15分钟
二、染色方法 1、免疫荧光技术
将已知的抗体标记上荧光素，再 用它检查细胞上的相应抗原。形成抗 原抗体复合物并带有荧光素；再用荧 光显微镜检查上述标本，可以清晰地 看见荧光所在的细胞，从而能检测某 种抗原的存在与否，并可结合定量技 术计算含量。