蛋白质复性-王蔚

层析复性
• 层析复性是将层析技术应用于蛋白质复性和纯 化,使变性蛋白质在层析柱上重折叠为正确的空 使变性蛋白质在层析柱上重折叠为正确的空 间构象,在洗脱的同时实现部分纯化 在洗脱的同时实现部分纯化。 间构象 在洗脱的同时实现部分纯化。 • 一. 吸附型层析复性 • 基本复性原理是柱平衡后 将变性蛋白上样并吸 基本复性原理是柱平衡后,将变性蛋白上样并吸 附在凝胶介质上,然后用清洗缓冲液洗掉未吸附 附在凝胶介质上 然后用清洗缓冲液洗掉未吸附 的变性剂和杂蛋白,最后用复性缓冲液将吸附的 的变性剂和杂蛋白 最后用复性缓冲液将吸附的 蛋白洗脱下来,在洗脱过程中完成复性 在洗脱过程中完成复性。 蛋白洗脱下来 在洗脱过程中完成复性。
蛋白质复性机制
• Bake 提出蛋白质折叠是由其拓扑学性质 决定的，这是“整体观”的研究思路： 决定的，这是“整体观”的研究思路： 在无数空间结构中， 在无数空间结构中，具有生理活性的蛋 白质结构是唯一的． 白质结构是唯一的．并且此拓扑结构的 熵值最小。 熵值最小。 • 蛋白质的折叠过程是一个熵值不断减小、 蛋白质的折叠过程是一个熵值不断减小、 从无序的松散肽链到有序的活性蛋白质 结构的演变过程。 结构的演变过程。
蛋白质复性机制
• 蛋白质结构可以看作为亲水／疏水作用 蛋白质结构可以看作为亲水／ 之间的平衡 • 一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及 一般认为，蛋白质在复性过程中， 两种疏水相互作用， 两种疏水相互作用，一是分子内的疏水 相互作用， 相互作用，二是部分折叠的肽链分子间 的疏水相互作用。 的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确 折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性， 折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性， 两者互相竞争， 两者互相竞争，影响蛋白质复性收率
透析复性
• 用变性液将蛋白稀释至较低浓度 01～ 用变性液将蛋白稀释至较低浓度(0. ～ 0. 2mg/ ml) 后装入透析袋中 用含低浓度 后装入透析袋中,用含低浓度 变性剂复性液低温透析。 变性剂复性液低温透析。 • 如果蛋白结构中含有二硫键 则在复性液 如果蛋白结构中含有二硫键,则在复性液 中加入适当比例的还原剂,是目前使用较 中加入适当比例的还原剂 是目前使用较 多的方法。 多的方法。
层析复性
• 二. 凝胶过滤层析复性 凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性( 凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性 SEC) ,是一 是一 种广泛应用的层析技术。 种广泛应用的层析技术。 谷振宇等人实现了脲梯度凝胶过滤复性, 谷振宇等人实现了脲梯度凝胶过滤复性 获得了很 好的效果。 好的效果。脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡 柱子,接着使变性剂浓度递减 如从6M 盐酸胍或 接着使变性剂浓度递减(如从 盐酸胍或8M 尿素 柱子 接着使变性剂浓度递减 如从 下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度) 下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度 Schlegl 等在 等在SEC 复性的基础上设计了一种连续 基质辅助蛋白复性系统,该系统能使变性蛋白定量地转 基质辅助蛋白复性系统 该系统能使变性蛋白定量地转 换成复性的天然态蛋白。 换成复性的天然态蛋白。此复性方法能够将复性过程中 产生的蛋白聚集体再次复性,使蛋白最大程度地得到回 产生的蛋白聚集体再次复性 使蛋白最大程度地得到回 等提出的伴侣溶剂塞(Chaperon solvent plug) 收。Liu 等提出的伴侣溶剂塞 SEC 复性法在一定程度上解决了变性蛋白进入柱顶端 之前发生沉淀这一问题。 之前发生沉淀这一问题。
• U→U-dm→→→U-dn-m→→→F→N
• 即伸展态 首先与去污剂d形成复合物 即伸展态u首先与去污剂 形成复合物 首先与去污剂 形成复合物ud ，加人环糊精后，小分子去污剂被逐 加人环糊精后， 次剥离下来，变为部分折叠、 次剥离下来，变为部分折叠、不含去污 剂分子的非活性状态F， 剂分子的非活性状态 ，进而折叠为天然 活性蛋白质N。 活性蛋白质 。
蛋白质复性机制
• 具有一定二级结构的松散肽链折叠成活 性蛋白质并不是一步完成的， 性蛋白质并不是一步完成的，而是经历 了伸展态或不完全伸展态、 了伸展态或不完全伸展态、熔球态等各 种结构的中间态到天然态的转变
蛋白质复性技术
• • • • • 稀释复性 透析复性 层析复性 分子伴侣辅助蛋白质复性 其他复性方法
分子伴侣辅助蛋白质复性
• 与GroE等蛋白质分子伴侣相比，联合使 等蛋白质分子伴侣相比， 等蛋白质分子伴侣相比 用去污剂和环糊精作为人工分子伴侣辅 助蛋白质复性具有明显的优点： 助蛋白质复性具有明显的优点：① 人工 分子伴侣不属于蛋白质， 分子伴侣不属于蛋白质，不易受环境影 响而失活，操作条件较为宽橙； 响而失活，操作条件较为宽橙；② 去污 剂和环糊精均可直接购买，省去分离纯 剂和环糊精均可直接购买， 化的步骤； 化的步骤；③ 去污剂与环糊精的分子量 较小，容易与蛋白质分离， 较小，容易与蛋白质分离，有利于提高 工业生产效率。 工业生产效率。
分子伴侣辅助蛋白质复性
分子伴侣辅助蛋白质复性
• 分子伴侣在蛋白折叠过程中可识别、捕 分子伴侣在蛋白折叠过程中可识别、 获错误折叠的蛋白,从而控制折叠过程 从而控制折叠过程,,从 获错误折叠的蛋白 从而控制折叠过程 从 而控制折叠过程,包括磷酸二酯酶 包括磷酸二酯酶、 而控制折叠过程 包括磷酸二酯酶、脯氨 酸异构酶、 酸异构酶、DnaK和GroE。 和 。 • GroE 是近年来研究的热点 是近年来研究的热点,GroE 由 GroES 和GroEL 组成。 组成。
蛋白质复性
主要内容： 主要内容：
• • • • 蛋白质复性研究背景 蛋白质复性机制 蛋白质复性技术 蛋白质复性展望
关键词： 关键词：
• 蛋白质复性 • 层析复性 • 分子伴侣
蛋白质复性研究背景
• 蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分 子物质，易受外界条件的影响发生变性。 子物质，易受外界条件的影响发生变性。随着 基因工程技术的发展， 基因工程技术的发展，许多实验通过将目的蛋 白基因转入原核或真核表达体系进行表达的方 得到需要的蛋白质， 法，得到需要的蛋白质，这大大丰富了蛋白质 的来源。但这些蛋白质， 的来源。但这些蛋白质，由于表达体系本身的 原因，或实验过程的处理， 原因，或实验过程的处理，多以无活性的形式 存在，需要进行复性。因此, 存在，需要进行复性。因此 对蛋白质复性的 研究必然的成为从基础的实验室生物工程研究 到最终临床应用过程中不可避免的一步。 到最终临床应用过程中不可避免的一步。
层析复性
• Lee 等利用此技术将 等利用此技术将rhGH2GST 和 rhIFN 2α22a 直接从细菌破碎液中提取出 变性的rhGH2GST 包涵 来并得以复性 ,变性的 变性的 体蛋白被吸附到STREAM2L INE DEAE 体蛋白被吸附到 树脂上,随着上样量的提高 随着上样量的提高,复性得率在下 树脂上 随着上样量的提高 复性得率在下 降低上样量不但可以提高复性率,也 降。降低上样量不但可以提高复性率 也 可以提高产品纯度。 可以提高产品纯度。
分子伴侣辅助蛋白质复性
• GroEL 蛋白辅助复性的 蛋白辅助复性的Fulrich 模型示图
分子伴侣辅助蛋白质复性
GroEL 蛋白辅助复性的 蛋白辅助复性的Hendrick 模型示图
分子伴侣辅助蛋白质复性
• 有研究者联合使用去污剂和环糊精作为 人工分子伴侣辅助蛋白质复性。 人工分子伴侣辅助蛋白质复性。 • 其反应机制可用下式表示： 其反应机制可用下式表示：
层析复性
• 3. 亲和层析复性(AFC) 亲和层析复性 利用固定相中的配体与目标蛋白质 之间特异性的吸附作用,使得目标蛋白质 之间特异性的吸附作用 使得目标蛋白质 可以保留在固定相中,蛋白与变性剂分离 可以保留在固定相中 蛋白与变性剂分离, 蛋白与变性剂分离 而后在洗脱过程中进行复性。 而后在洗脱过程中进行复性。 依其AFC 柱端基的不同 可将其分 柱端基的不同,可将其分 依其 固定化金属亲和层析、 为:固定化金属亲和层析、分子伴侣亲和 固定化金属亲和层析 层析和脂质体亲和层析。 层析和脂质体亲和层析。
其他复性方法
• 研究发现 聚乙二醇(polyethy2lene 研究发现,聚乙二醇 聚乙二醇 glycol ,PEG) 可以通过疏水和亲水作用与 蛋白相互结合,形成非聚合二级中间体蛋 蛋白相互结合 形成非聚合二级中间体蛋 白折叠中间体,可抑制蛋白质复性过程中 白折叠中间体 可抑制蛋白质复性过程中 的凝聚沉淀,提高蛋白质复性率 提高蛋白质复性率。 的凝聚沉淀 提高蛋白质复性率。 • 添加肽基 晡氨酰基顺反异构酶、L-精氨 添加肽基-晡氨酰基顺反异构酶 晡氨酰基顺反异构酶、 精氨 酸 和谷胱苷肽 等促使蛋白质某些结构位 点的形成，也可促进蛋白质折叠复性。 点的形成，也可促进蛋白质折叠复性。
层析复性
• 4. 扩张床吸附复性( 扩张床吸附复性 EBA) 英国剑桥大学的Chase 等松状态下实现平推流 英国剑桥大学的 的扩张床吸附技术。该技术是利用扩张床吸附层析直 的扩张床吸附技术。 接从细菌裂解变性液中捕获并复性目标蛋白。 接从细菌裂解变性液中捕获并复性目标蛋白。其过程 是将细菌破碎液直接加入高浓度的变性剂,然后上样 是将细菌破碎液直接加入高浓度的变性剂 然后上样 到扩张好的柱床上,在上样过程中 在上样过程中,细胞碎片和不吸附 到扩张好的柱床上 在上样过程中 细胞碎片和不吸附 的杂质流穿掉,而变性蛋白被吸附在凝胶上 而变性蛋白被吸附在凝胶上,然后用含 的杂质流穿掉 而变性蛋白被吸附在凝胶上 然后用含 变性剂的缓冲液清洗掉剩余杂质,再用不含变性剂的 变性剂的缓冲液清洗掉剩余杂质 再用不含变性剂的 缓冲液洗掉变性剂,将扩张床沉降后 用洗脱缓冲液将 缓冲液洗掉变性剂 将扩张床沉降后,用洗脱缓冲液将 将扩张床沉降后 目标蛋白洗脱下来,而通过吸附 清洗和洗脱的过程, 而通过吸附、 目标蛋白洗脱下来 而通过吸附、清洗和洗脱的过程
分子伴侣辅助蛋白质复性
• 分子伴侣是一组在胞内活动中起重要作 分子伴侣是一组在胞内活动中起重要作 用的多种蛋白和酶的总称。 用的多种蛋白和酶的总称。 • 目前分子伴侣由于使用费用高 并需要与 目前分子伴侣由于使用费用高,并需要与 复性蛋白质分离,在实际应用中较难开展 在实际应用中较难开展。 复性蛋白质分离 在实际应用中较难开展。
蛋白质复性机制
• 针对疏水作用在蛋白质三级结构上所占的突出 地位和对蛋白质稳定性的重要影响， 地位和对蛋白质稳定性的重要影响，学者们提 出了两种折叠过程假设。 出了两种折叠过程假设。 • 一种假设认为肽链中的一些构象单元首先形成 一螺旋、 一折叠 转角等二级结构． 一折叠、 一螺旋、B一折叠、 转角等二级结构．然后二 级结构之问进行组合， 级结构之问进行组合，最后排列成三级结 构 ．这足一种从低级结构向高级结构逐步演化 假设。 的“完美 假设。 • 另一种假设队为蛋白质的折叠首先是肽链内部 疏水基团的识别并产生一个塌陷过程． 疏水基团的识别并产生一个塌陷过程．然后经 过悯整形成不同层次的结构．最终折叠为活l生 过悯整形成不同层次的结构．最终折叠为活 生 构象。 构象。
ห้องสมุดไป่ตู้
稀释复性
• 通过用缓冲液和低浓度的变性液稀释包 涵体蛋白液,降低变性剂的浓度 降低变性剂的浓度,促进蛋白 涵体蛋白液 降低变性剂的浓度 促进蛋白 分子的重新折叠。 分子的重新折叠。 • 稀释方法有一步稀释、分步稀释和脉冲 稀释方法有一步稀释、 稀释,稀释后扩大蛋白体积不利于后续工 稀释 稀释后扩大蛋白体积不利于后续工 目前使用较少。 作,目前使用较少。 目前使用较少
层析复性
离子交换层析复性( 离子交换层析复性 IEC) 捷克科学家J 捷克科学家 . Suttnar 等首次使用了 强阴离子交换法 对HPV 16E7MS2 融合蛋白成 功地实现了复性。 功地实现了复性。 • 2. 疏水相互作用层析复性 HIC) 疏水相互作用层析复性( 耿信笃等首次用HIC 对重组人干扰素 耿信笃等首次用 2γ(rhIFN2γ) 和rhIFN2α分别在复性的同时进行 分别在复性的同时进行 了纯化[1 并对其复性机理进行了详细论述 并对其复性机理进行了详细论述。 了纯化 ] ,并对其复性机理进行了详细论述。 关怡新等首次在疏水层析中使用等尿素梯 度和线性尿素梯度对rhIFN2γ包涵体进行复性 度和线性尿素梯度对 包涵体进行复性 • 1.