芯片技术的应用

芯片制作工艺的进展
1980年Bains等将预先合成的短DNA片
段固定在固相支持物上进行的杂交测序 实验是基因芯片的最原始模型，所以合 成点样是基因芯片制作的最原始的方法 由Affymetrix公司发展起来的光导 ODTA合成照相平板印刷术将基因芯片 引入了工业化生产的阶段。
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将样品处理、芯片杂交和信号检测集于一
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基因芯片制备的两种基本方法
原位合成
直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针
合成点样
将已经合成好的探针定位在芯片上
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原位光刻合成
由美国Affymetrix公司开发
Picture from UKBF: http://www.ukbf.fu-berlin.de/
Affymetrix Website: http://www.affymetrix.com/
标记。
靶基因样品的制备方法将根据基因芯片的
而决定。
类型和所研究的对象（如mRNA、DNA等）
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3.1 靶基因的制备
核酸样品制备是基因芯片分析的必须步
骤，传统的化学提取法比较费时，不能 人们发明了与芯片相结合的核酸提取方
满足基因芯片对快速高效的要求。因而， 法。
芯片微过滤法
生物电子芯片法
化学喷射法
此种方法先进之处在于采用了压电和其
他推动方式从微型喷嘴向固体表面转移
生化成分。
该技术正由Incyte Pharmaceuticals
(Palo Alto, CA, USA)和Protogene (Palo
Alto, CA, USA)等几处中心进行发展。
方法与步骤
用与压电接口（方型）相连的微型 喷嘴将生化物质喷向基底，通过电 流控制使样品体积得到精确控制。 第一轮结束后，清洗喷嘴进行下一 步。
电场作用下预先合成的生物素标记的探针即
可结合在特定电极上。
AVI from Nanogen:
http://www.nanogen.com/
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最早由美国Nanogen公司开发，目前国内清 华大学和复旦大学也在开发这一技术。
最大特点：
杂交速度快，可大大缩短分析时间。
最大不足：
芯片制备复杂、成本较高。
4. 更换掩膜M2，重复1-2，直到所需要的探针阵列合
成完毕（4-6）。
使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出 高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指 数增长。
某一含ｎ个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n
个化学步骤能合成出4n个可能结构。
例如：一个完整的十核苷酸通 过32个化学步骤，8个小时可能
基因芯片制备技术
靶基因的制备
杂交和检测
提出问题 芯片设计
基因芯片设计
杂交图像分析 ……
芯片制作 原位合成 合成点样
表达差异分析 多态性分析 再测序
生物信息学 数学优化 数据库 标准化
试样处理
PCR扩增 靶基因标记
芯片杂交
实际应用
数据分析
杂交检测
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1.基因芯片的主要类型
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然而如何充分利用新序列信息资源，怎样 去研究如此众多基因的生物信息及其在生 命过程中所担负的功能，成为生命科学工 作者的共同课题。
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已建立的诸如Northern印迹、RNA酶保 护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交以及 狭线印迹等方法不能提供足够通量来有 效地利用新的基因组学的资源。为此， 必须发展高通量或平行监测基因表达的 新方法。 基因芯片技术正是在这样的背景下应运 而生。
主要采用荧光分子标记：
常规标记——在扩增过程中加入含有荧
光标记的dNTP（至少一种为荧光标记）。 末端标记——直接在引物上标记荧光。
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4.靶基因的杂交及其信号检测
荧光显影法 质谱法 化学发光法 光导纤维法 压电石英谐振法 ……
步骤
1. 把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保 护基团，此光保护基团可被一定波长
的光激活并脱保护。
2. 根据所要制作的阵列的需要设计光刻
掩膜。将掩膜（M1）覆盖在修饰过的
基片上，用光照射使曝光区域的基片 表面脱除保护基团而形成活性羟基 （1-2）。
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3. 引入5`端被X基团保护、3`端被活化的单核苷酸 dNTP，使dNTP的3`端与基片上的活性羟基缩合， 洗去未有效结合的dNTP（3）。
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早在80年代初期，有人就曾设想利用
计算机半导体技术生产基因芯片以对
人类基因大量的遗传信息进行分析和
检查。
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但直到1994 年Pease等人创造的光导原位合成高
密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问
世之后，才使该设想逐步成为现实。
因此可以说光导ODTA
化学合成法，为基因芯
片技术奠定了基础。
采用了平面微细加工技术，可实现大批量 生产。通过提高集成度，降低单个芯片的
成本
可组装大量的（104--106种）生物分子探
针，获取信息量大，效率高，特别适合于
基因信息的采集。 结合微机械技术（MEMS），可把生物样 品的预处理，基因物质的提取，扩增，以 及杂交后的信息检测相集成，制备成微物
体的所谓“缩微实验室”逐渐成为基因芯
片发展的新趋势。在这方面主要有以下技
术较为成功：
电子芯片 •流过式芯片
三维芯片
•石英谐振芯片
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电子芯片
片基为带有正电荷的硅片，硅片经热氧化， 制成1mm2的阵列，每个阵列含多个微电极， 在每个电极上通过氮化硅沉积和蚀刻制备出 样品池。
将链连有亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在
增加了敏感性。
可以在芯片上同时进行扩增与检测。 是该技术不仅可以用于基因芯片，也可 以制作蛋白芯片。
美国的Packard、摩托罗拉、Argonne国家实验室三家 机构与俄罗斯Engelhardt分子生物学研究所合作开发。
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流过式芯片
在芯片片基上制成格栅状微通道，将预 先设计及合成的特定寡核苷酸探针结合 于芯片上微通道内的特定区域。
合成65,536（即216）个探针。
Picture From BROWN LAB http://cmgm.stanford.edu/pbrown/
原位喷印合成
芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，
不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的
是四种碱基等液体而不是碳粉。 采用的化学原理与传统 的DNA固相合成一致，因
通过在硅芯片上制作 一系列各种排列的金 属电极和在这些电极 上施加高频电场，使 不同的细胞内感应出
细菌或病毒从血清、
水样或其他液体样品
中分离而设计的用作
介电电泳的细胞分离 方法。
偶电极。偶电极的出
现反过来使细胞承Leabharlann Baidu 从而使细胞从各种液 体样品中分离出来。
正介电力或负介电力，
Picture from Nanogen website: http://wwww.nanogen.com
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芯片微过滤法
宾夕法尼亚大学的研究小组针对人白细
胞的分离设计的一种核酸样品制备方法。 微过滤芯片是通过在硅片上刻出几个微 米大小的各种形状的过滤微通道，再在 硅芯片上加上一块玻璃盖片而成。 发展经历了竖式Z型结构、竖式条状梳式 结构到最终的横坝式结构。
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生物电子芯片法
为了把不同的癌细胞、
基因芯片视分类方法不同可分为不同类型
无机芯片 片基或支持物
有机合成物芯片
光引导聚合法
原位合成 喷墨打印合成法（压电打印法）
探针阵列形式
合成点样
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基因芯片的主要类型及其简要特点
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2.基因芯片的制备
基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸
阵列
制造基因芯片首先要解决的技术问题就
是如何在芯片片基上定位合成高密度的 核酸探针
现在全世界已有十多家公司从事基因芯片 研究和开发工作，而且已有较为成型的产 品和设备问世。这些公司主要以美国的
Affymetrix公司为代表。
美国“Fortune”杂志在1997年3月对基因芯片 技术未来产业化的前景进行了重点介绍。 图片来自益来基因网: http://www.el-gene.com/
Picutre from UKMSTS Suimmit Conference: http://www.cmf.rl.ac.uk/presentations/
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从待测样品中分离DNA或RNA并对其 进行荧光标记。 将标记的靶核酸样品流过芯片，固定在 芯片上微通道内的寡核苷酸探针捕获与 之相互补的靶核酸。
图片来自益来基因网: http://www.el-gene.com/
256*256分子印章阵列显微图 （0.18%)
高密度芯片DNA阵列显微图（0.16%）
高密度芯片DNA阵列荧光杂交图（0.09%）
分子印章多次压印合成法点样机
图片来自益来基因网: http://www.el-gene.com/
优势与特点
此不需要特殊制备的化学
试剂。
Picture from BioDot: http://www.biodot.com
分子印章多次压印合成法
1.根据所需微阵列，设计有凹 凸的微印章，然后根据预先设 计在制备的各级印章上涂上对 应的单核苷酸。 2.按照设计的顺序将不同的微 印章逐个依次压印在同一基 片上，得到256×256阵列的 高密度基因芯片。
价格降低，由于采用了特殊的共价化学技术
将寡核苷酸吸咐于微通道内，使每一种流过
式芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。
Gene Logic 正在开发 http://www.genelogic.com
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3.靶基因样品的制备
靶基因的制备需要运用常规手段从细胞和
组织中提取模板分子，进行模板的扩增和
微型机械点样法 ＋ 化学喷射法
微型机械点样法
该技术由Shalon和Brown于1995年发展 起来的另一类具有生命力的基因芯片制 备技术。 美国Synteni公司最终发展出商品仪器， 完成其商品化。
方法与步骤
通过毛细作用使用点样针将生化物质转移
到固体基底表面（点样针与基底表面接
触）。 第一轮结束后，清洗点样针进行下一轮操 作。 机器人控制系统可使其实现自动化生产。
芯片。
高密度——分辨率高
准确性——合成产率高
一致性——工艺最优化 批量化——平面印刷法
合成点样
合成点样技术在基因芯片尚处于实验
研究阶段时是唯一的芯片制造手段，
曾一度被原位合成技术的光芒所掩盖。
随着原位合成技术缺点的暴露和自动
化技术的进步，合成点样技术又重现
生机。
是将合成好的探针、cDNA或基因组 DNA通过特定的高速点样机器人直 接点在芯片上。 目前，除Affymetrix等研究和生产基 因芯片的少数大公司使用原位合成 外，其他中小型公司和实验室研究 中仍然普遍采用合成点样法。
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二.基因芯片的定义
又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基 因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后 与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再 通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配
以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，
从而迅速得出所要的信息。
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三.基因芯片相关技术及其进展
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美国的Nanogen公司通 过在微过滤芯片的电极 上施加一系列高压脉冲 对电极上分离得到的大 肠杆菌细胞进行进行电 子胞解，获得了大肠杆
菌细胞内的各种RNA和
DNA。
Picture from Nanogen website: http://wwww.nanogen.com
3.2 靶基因的扩增与标记
Picture from Nanogne website: http://www.nanogene.com/
三维芯片
片基上为大量的微小聚乙烯酰胺凝胶条，每个 凝胶条可用DNA分析。 先把已知化合物加在凝胶条上，用3cm长的微 型玻璃毛细管将待测样品加到凝胶条上。
应用优势
凝胶条的三维化能加进更多的已知物质，
Picutre from UKMSTS Suimmit Conference: http://www.cmf.rl.ac.uk/presentations/
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特点
敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大， 流过式芯片可监测稀有基因表达的变化。 速度快，微通道加速了杂交反应，减少了每
次检测所需时间。
基因芯片技术及临床应用
一.概述
随着人类基因组测序计划的逐步实施以及分 子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的 动植物、微生物基因组序列得到测定。
在GenBank数据库中已含有300万个序列，总
数超过22亿个碱基对，其中包括19种不同生
物体的完整序列、近9 000个已知功能或已推
测功能的人类基因序列。 基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速 增长。