His标签蛋白包涵体的变复性及其纯化

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His标签蛋白纯化步骤

若目的蛋白在上清表达,则使用试剂盒buffer(Novagen His•Bind Purification Kit, 70239);若为包涵体,则需自配buffer。

(1)试剂准备

①12.5mL 1×charge buffer (1.6mL原液+10.9mLSW)

②32.5mL 1×binding buffer (4mL原液+28.5mLSW)

③15mL 1×wash buffer (1.9mL原液+13.1mLSW)

④15mL 1×Elute buffer (3.8mL原液+11.2mLSW)

(2)装柱

①盖上下盖,轻轻混匀His-bind Resin(若柱子不是首次使用,只需把已再生的柱床小心重悬,同样过夜沉降即可)。

②转移4mLHis-bind Resin至柱中,沿管壁流下,一次性加足,否则胶面会形成断面,影响吸附效果。

③用封口膜封住上口,置4℃冰箱,沉降过夜。

(3)过柱前准备(大约1h)

①使胶床上液依重力自动流下。

②待留至床顶时,依次加入以下溶液(用滴管沿管壁小心加入,且要一次性加足)

a.7.5mL无菌SW

b.12.5mL 1×charge buffer

c.7.5mL 1×binding buffer

注:各步骤间连接要流畅,勿使胶床干燥

(4)上样过程

上样时同前一样,要小心贴壁加入,可一次性加满柱子(会使样品流有较大压力),随时可补加样品,使柱子保持满的状态。

(5)洗脱

依次加入:①25mL 1×binding buffer ②15mL 1×wash buffer ③15mL 1×Elute buffer 收集前8管(首先塞上下面的塞子,室温放置20min,再收集)

跑PAGE胶,进行蛋白浓度测定。

(6)柱再生

①1×strip buffer配制7.5mL 1×strip buffer:1.9mL原液+5.6mLSW

②柱子纯化完后,加入7.5mL 1×strip buffer,洗涤至液面稍高于床顶,用塞子封住下口,

直立放置4℃过夜

③次日依次加入:

5mL 6M盐酸胍0.2N乙酸(57.3g盐酸胍+1.2mL冰乙酸+SW→100mL)

5mL SW

2.5mL 2%SDS

2.5mL 25%无水乙醇

2.5mL 50%无水乙醇

2.5mL 75%无水乙醇

12.5mL 100%无水乙醇

2.5mL 75%无水乙醇

2.5mL 50%无水乙醇

2.5mL 25%无水乙醇

2.5mL SW

12.5mL 100mM EDTA pH8.0 (1.861gEDTA+50mL SW调pH8.0)

7.5 mL SW

7.5 mL20%无水乙醇(加满细柱部分)

4℃保存柱子

若His标签蛋白为包涵体,则需先进行变复性,步骤如下:

①收集菌体(离心,8800rpm,15min),弃上清

②PBS洗3遍

③40mL(若为400mL菌液)1×binding buffer(非变性)重悬菌体,超声波裂解至菌液

变澄清(中途可离心收集沉淀,再次重悬,裂解,以释放更多的杂蛋白)。

④离心,8800rpm,15min,弃上清,目的蛋白存于沉淀中,30mL(若为400mL菌液)1

×binding buffer(变性)重悬。

⑤冰上孵育1h(或过夜),以便完全溶解蛋白,离心15000rpm,30min,以除去不可溶物

质→0.45μm滤膜过滤上清后再过His纯化柱。

8×binding buffer(40mM咪唑,4M NaCl,160mM Tris-HCl pH7.9)

咪唑(68.08g/mL)0.272g

NaCl(58.45g/mL)23.37g

Tris(121.14g/mL)1.93g

SW定容至100mL,调pH7.9

1×binding buffer(100mL)

8×binding buffer 12.5mL

SW 87.5mL

含6M尿素的1×binding buffer

8×binding buffer 12.5mL

尿素36.036g

SW定容至100mL,调pH7.9

变性的1×wash buffer(6M尿素,20mM咪唑,20mM Tris,0.5M NaCl)

尿素7.2g

NaCl 0.5845g

咪唑0.0272g

Tris 0.04845g

SW定容至20mL,调pH7.9

变性的1×Elute buffer(1M咪唑,6M尿素,0.5M NaCl,20mM Tris)

尿素7.2g

NaCl 0.5845g

咪唑1.36g

Tris 0.04845g

SW定容至20mL,调pH7.9

若目的蛋白在上清表达,只需PBS洗三遍,PBS重悬,超声波裂解至澄清,离心8800rpm,15min,上清即为样品。

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