【CN110218811A】一种筛选水稻突变体的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910379866.0

(22)申请日 2019.05.08

(71)申请人 中国科学院植物研究所

地址 100093 北京市海淀区香山南辛村20

号

(72)发明人 漆小泉　张英春　冯来宝　池旭　

(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限

公司 11245

代理人 魏少伟

(51)Int.Cl.

C12Q 1/6895(2018.01)

C12Q 1/686(2018.01)

C12N 15/11(2006.01)

(54)发明名称

一种筛选水稻突变体的方法

(57)摘要

本发明公开了一种筛选水稻突变体的方法。

本发明公开的筛选水稻突变体的方法包括：利用

多重PCR富集待测水稻中的目标DNA片段，得到富

集的目标DNA片段；对富集的目标DNA片段测序，

得到待测水稻目标DNA片段序列；比较待测水稻

目标DNA片段序列与野生型水稻目标DNA片段的

序列，确定待测水稻目标DNA片段是否发生突变，

以确定待测水稻是否为突变体。实验证明，利用

本发明的方法可成功检测目标DNA片段是否发生

突变，

进一步可用于筛选突变体。

权利要求书3页 说明书43页序列表1页 附图7页CN 110218811 A 2019.09.10

C N 110218811

A

权　利　要　求　书1/3页CN 110218811 A

1.鉴定生物目标DNA片段突变的方法，包括：

1)利用多重PCR富集待测生物中的目标DNA片段，得到富集的目标DNA片段；所述利用多重PCR富集待测生物中的目标DNA片段包括利用多重PCR方法扩增得到目标DNA片段，实现目标DNA片段的富集；所述多重PCR方法，包括：利用成套引物对目标DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物，将该PCR产物记为PCR产物1；所述成套引物满足如下a1)、a2)和a3)：a1)所述成套引物由n个引物对组成，n为大于等于2的自然数；

a2)所述成套引物中的每个引物对的因素J小于50％，所述因素J为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物形成引物二聚体的个数占所述成套引物中引物个数的百分比；

a3)所述成套引物中的每个引物对的9个因素中至多一个因素不在标准范围内；所述9个因素为因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；

所述因素A为引物对的反向引物的GC含量；

所述因素B为引物对的反向引物的TM值，

所述因素C为目标片段的GC含量；

所述因素D为从目标片段上游400bp处至该目标片段下游400bp处间的DNA片段的GC含量；

所述因素E为目标片段的结构自由能；

所述因素F为目标片段及目标片段下游150bp的连续DNA片段的结构自由能；

所述因素G为目标片段及目标片段上游150bp的连续DNA片段的结构自由能；

所述因素H为引物对的正向引物3’末端5个核苷酸的结构自由能；

所述因素I为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物中部连续大于等于5个核苷酸所形成的多个双链DNA的TM值总和；

所述9个因素的标准范围如下：

35％≤所述因素A≤60％；

68℃≤所述因素B≤79℃；

30％≤所述因素C≤70％；

30％≤所述因素D≤70％；

15kcal/mol≤所述因素E的绝对值≤70kcal/mol；

所述因素F的绝对值＜100kcal/mol；

所述因素G的绝对值＜100kcal/mol；

4kcal/mol≤所述因素H的绝对值≤10kcal/mol；

所述因素I＜100℃；

2)对所述富集的目标DNA片段测序，得到待测生物目标DNA片段序列；

3)比较所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列，确定所述待测生物目标DNA片段是否发生突变：所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列相同，所述待测生物目标DNA片段未发生或候选未发生突变；所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列不同，所述待测生物目标DNA 片段发生或候选发生突变。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述成套引物中各引物对的正向引物含有相同的序列，记为正向引物共同序列；各引物对的反向引物含有相同的序列，记为反向引物

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