实验设计

甲醛熏蒸消毒法实验设计

『实验目地』：探究甲醛熏蒸消毒法的消毒灭菌效果评价

『实验原理』：1 阻止细菌核蛋白的合成，影响微生物细胞浆的基本代谢

2 甲醛是强烷化基，甲醛分子直接作用于细菌的菌体蛋白质，酶，核酸和活性基团，使得蛋白质链上的氨基，亚氨基，巯基，羟基等烷基化。从而破坏细菌蛋白质，导致微生物死亡（1是降低水对蛋白质的穿透和澎润，使其硬化。2是对核酸的烷基化反应，导致病毒灭活）

『实验材料』：5%的麝香草酚溶液，36%甲醛溶液，高锰酸钾溶液，75% 酒精溶液，5mol／L NaOH 溶液，AHMT溶液，KIO4 溶

液，支架，培养皿，试管，分光光度计

『实验步骤』：

1、消毒前进行实验室细菌培养：实验室消毒前，用5 个9 cm 普通平板培养基对实验室内空气沉降15 min 采样。分别置于实验室的4 个角落以及中央位置，相当于人的呼吸道高度[9]。将采样后的平板置于37 ℃培养箱培养48 h 后，计数菌落数量。

2、甲醛熏蒸消毒：

（1）用注射用水擦洗建筑物与设备表面，然后用5%的麝香草酚溶液擦洗或喷洒，最后再用注射用水擦拭建筑物与设备表面。

（2）计算消毒空间体积：包括房间体积与风管体积，按10ml/m³准备36%的甲醛溶液，按2-3㎎/m³准备高锰酸钾溶液。

（3）在各个房间内布置实验装置：如培养皿、支架、

（4）消毒前准备：关闭空调机，在设定的地点放置装有定量高锰酸钾的容器，双层纱布盖住容器口，旁边配有定量36%甲醛溶液，设定地点的数目应与房间面积有关。

（5）消毒：将甲醛溶液倒入装有高锰酸钾的容器中，迅速离开房间，让甲醛气体扩散30分钟，开启空调机20分钟，关闭空调机，熏蒸开始，不低于7个小时后打开空调机进行排气。

（6）熏蒸后空气总甲醛残留量的测试：在排气后，首先确定空气中的甲醛含量，人的嗅觉对特殊气体的最低浓度为0.55*10-6 ，而甲醛的环境标准为（1-2）*10-6，为了保证人能在洁净室内安全健康地工作，必须要对甲醛的残留量进行测试。3、结核分枝杆菌PCR 特异性检测

对实验室内易污染部位进行甲醛熏蒸消毒后采样对比，（取样培养：在洁净室内排气一定时间后，取培养基进行培养，合格的标准是与对照试纸相比灭菌试纸的结核杆菌的数量不高于其千分之一。）包括：实验室门把手、实验台面、生物安全柜门把手、显微镜调节钮二氧化碳培养箱门把手、冰箱门把手、传递窗按钮以及高压灭菌器开关及把手等用浸有无菌生理盐水的棉签往返 5 次擦拭各采样点后，将棉签浸入采样管中所有采样标本用DNA 试剂盒抽提DNA 后进行PCR 扩增。PCR 引物序列为：上游引物5' CAGTGGAATTTCGCGGGTATC 3'，下游引物5' CGTTGTTCAGCTCGGTAGCC 3'，可特异性扩增200 bp 左右的结核分枝杆菌早期分

泌蛋白6（ESAT-6）基因片段。PCR 反应体系包含cDNA 1 μl，dNTP mix （10 mmol/L）0.5 μl，上下游引物1 μl（10 μmol/L)，Taq DNA 聚合酶0.125 μl （5 U/μl），Mg2+（25 mmol）3 μl 和5 ×PCR buffer 5 μl，加重蒸水至25 μl。反应条件：95 ℃5 min；94 ℃40 s，60 ℃50 s，72 ℃1 min，循环35 次；最后72 ℃7 min 终止反应。实验设置阳性和阴性对照。

以1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物，凝胶成像仪下观察记录结果。

熏蒸后甲醛残留量的测试；

1.取样：用30L塑料袋收集室内的气体（样本要多于3个）。

2.配制准备收集液、实验液：将20ml 0.5%硼酸溶液作为收集液，将收集的样

本气体充分通过收集液，保证甲醛被吸收完全，然后将吸收液转移到25ml 容量瓶中，加水至满刻度。

3.实验操作：

①取供试液 2.0ml 至带栓试管中，加5mol／L 的NaOH 溶液 2.0ml 及

AHMT 溶液2．0ml，轻摇数次混匀后，室温放置20min。然后加KIO4 溶

液2.0ml，摇2～5min 至无气泡生成为止; 同时用水2.0ml 同法制成对照液，在波长550nm 附近测最大吸光度。

②分别取甲醛标准液0.5ml、1.0ml、l.5ml、2.0ml，加水使成2.0ml，然后按

①操作，测定吸光度，制出甲醛浓度(ug／m1)与吸光度的关系检量线。

4.计算甲醛浓度

式中α——供试液中甲醛浓度，μg/ml；

V——采样气体量，L；

t——采样时平均温度℃；

22.4——l mol 气体在0℃、1个大气压下的体积（L）；

30.03——甲醛相对分子质量；

25——供试液全量（ml）。

『注意事项』：1、实验室要密封，能够对实验室进行熏蒸消毒的有效药物是甲醛气体，它在实验室内的浓度越高、停留时间越长，消毒的效果就越好。因此，熏蒸消毒之前，一定要用塑料薄膜或胶带将实验室的所有门窗、墙壁及其缝隙等密封好；熏蒸消毒之后，还要再密封1天以上。

2、选择合适的容器，福尔马林和高锰酸钾均有腐蚀性，它们混合发生的化学反应剧烈，持续时间达10分钟～30分钟，并释放出大量的热。所以，盛放福尔马林和高锰酸钾的容器体积要尽可能大一些，一般不能小于福尔马林容积的4倍，并最好是耐腐蚀、耐热的陶瓷或搪瓷容器。

3、控制好消毒药的浓度，用于熏蒸消毒的福尔马林浓度不得低于35%，它与高锰酸钾的混合比例要求达到2∶1。福尔马林和高锰酸钾的混合比例是否合适，可根据其反应结束后的残渣颜色和干湿程度进行判断：若是一些微湿的褐色粉末，说明比例合适；若呈紫色，说明高锰酸钾用量过大；若太湿，说明福尔马林用量过大。

4、选择合适的位置，消毒容器应均匀地置于实验室内，且尽量离实验室门口近一些，以便使甲醛气体能够更好地弥漫于整个实验室空间，并有利于工作人