谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)活性测定试剂盒使用说明

谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）活性测定试剂盒使用说明

产品简介：

GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，通常昆虫中GR被TrxR取代，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR 还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。

GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时不断消耗NADPH；通过测定NADPH减少量，即可测定GR活性。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1ml比色皿、双蒸水

产品内容：

试剂一×1支，充分溶解于100ml双蒸水，4℃保存3个月

试剂二×1支，充分溶解于6ml双蒸水中，4℃保存3个月

试剂三×2支，临用前配制，每支充分溶解于3ml双蒸水中

操作步骤：

一、样品前处理：

取组织约0.1g，加1ml试剂二，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清。（如上清不清澈，再离心3min）

GR测定操作：

测定前将试剂一于25℃水浴20min

二、测定操作表：

测定管空白管

试剂一0.75ml0.85ml

试剂二0.05ml0.05ml

样本0.1ml/

试剂三0.1ml0.1ml

迅速混匀，于340nm处测定3min内吸光值变化，第0s吸光值记为A1，第180s吸光值记为A2。

GR活力计算：

GR活力单位定义：在25℃，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟氧化1mmol NADPH的酶量为1U（U/mg prot）。

计算公式：

GR酶活(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)/3÷6.22×（V总/V样）×稀释倍数×1000/Cpr=(△A测定管-△A空白管)×535.91×稀释倍数÷Cpr

△A=A1-A2，6.22：NADPH的毫摩尔消光系数，V总：反应总体积（ml），V样：所用样品体积（ml），Cpr：蛋白浓度（mg/ml）。

注意事项：

（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

（2）试剂三须现配现用，配置完后，置于冰上；

（3）测定前须先用1～2个样做预实验，确保180s内吸光值变化呈线性，哺乳动物组织一般须用试剂一（生理盐水）稀释2～5倍；

（4）细胞中GR活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GR的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞