限制性内切酶

EcoRⅠ的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
切口：粘性切口和平端切口
EcoRⅠ —GAATTC— —CTTAAG— —G + AATTC— —CTTAA G— 粘端切口 HpaⅡ —GTTAAC— —CAATTG— —GTT + AAC— —CAA TTG— 平端切口
（二）基因工程的基本定义
（三）克隆的定义
（一）重组DNA技术
（recombinant DNA technology）
是指在体外按人们的意愿将不同的 DNA分子重组的技术。
（二）基因工程
(Genetic engineering)
是指利用重组DNA技术将目的基因 和载体重组，再导入受体细胞内进行扩
增和表达的过程。
（三）克隆 （clone）
是指通过无性繁殖过程所产生的 与亲代完全相同的子代群体。 基因工程相当于目的基因的无性 繁殖过程，也称其为基因克隆 (gene cloning)。
二、基因工程操作中常用的工具
(一)工具酶来自百度文库
(二) 载 体
（一）工具酶
1 限制性内切酶
2 T４ DNA连接酶
3 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
三 、基因工程的操作过程
（一）目的基因的获得
（二）目的基因与载体的连接
（三）重组体导入受体细胞
（四）基因工程菌的筛选
（五）外源基因的表达
（一） 目的基因的获得
1.构建基因组DNA文库 基因组DNA文库(genomic DNA library) 2.构建cDNA文库 cDNA文库(cDNA library) 3.人工合成法 要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物 的氨基酸序列 4.聚合酶链反应 (polymerase chain reaction ,PCR)
2.λ 噬菌体（bacteriophage, phage）
蛋白衣壳
头部
尾
尾部纤维
3. 粘粒 (cosmid) ：
由λ噬菌体的cos区与pBR322质粒 组合的杂种载体。粘粒可克隆29-
45kb的大片段，常用作建立真核基
因组文库的载体。
4.病毒（virus）
病毒载体更多用于真核表达 系统，如腺病毒，腺病毒相关病 毒、痘病毒，逆转录病毒，猴空 泡病毒等。
4 逆转录酶 5 T4多核苷酸激酶 6 碱性磷酸酶 7 末端脱氧核苷酸转移酶
1．限制性内切酶(restriction endonuclease)
定义: 一类能识别和切割双链DNA 分子中特定碱基序列的核酸水解酶。 分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
1.质粒（plasmid）
定义： 是染色体外能自我复制的 双链环状小分子DNA。
特点：
能在宿主细胞内独立复制， 带有某些遗传信息，会赋予宿主 细胞一些遗传性状。
pUC19质粒的物理图谱
pBR322质粒
基因工程中使用的质粒具备的特点


质粒的复制型 分为松弛型和严谨型两类。 质粒的不相容性 作为载体的质粒一般是不相容的。 质粒的接合性 用作载体的质粒都是非接合性质粒。 多克隆位点 即多种限制性内切酶的单一识别序列。 筛选标记 常用双抗生素抗性插入失活筛选标记和 蓝白菌落筛选标记。
转移到DNA或RNA的5‘端羟基上。

碱性磷酸酶简称AKP，此酶能特异的切除 DNA或RNA5‘端的磷酸产生5’端羟基以 防止载体的自身连接。 末端脱氧核苷酸转移酶能催化单核苷酸转

移到DNA的3‘端的羟基上。
（二） 载体
是携带目的DNA片段进入受体 细胞进行扩增和表达的工具。 常用载体： 质粒 噬菌体 粘粒 病毒
（三）重组体导入受体细胞
1. 受体菌的条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 2. 导入方式： 转化(transformation) 转染(transfection) 转导(transduction)
（四）基因工程菌的筛选
1. 抗药性标记选择 2. 标志补救 ： α互补
3. 分子杂交法：原位杂交
基因技术
哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室 高旭 刘兴汉
基因操作技术
1 基因工程
2 分子杂交
3 聚合酶链反应
4 DNA序列测定
5 转基因动物
6 基因剔除技术
7 克隆动物
8 基因诊断和基因治疗
第一节
基因工程
（ Genetic engineering）
一、基因工程的基本概念
（一）重组DNA技术的基本定义
Southern印迹
4. 免疫学方法:如免疫化学方法
酶免检测法
1. 抗药性标记选择
pBR322质粒—双抗生素抗性
2. 标志补救 ： α互补
bla=氨苄青霉素抗性基因 Ori=复制起始点 lacZ’=β-半乳糖苷酶N端编码序列
2. 其他相关酶类

T４ DNA连接酶用于互补粘性末端和
平端DNA分子之间的连接。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5‘→3’的聚合
作用，5‘→3’外切作用和3ˊ→5ˊ的外切作用。

逆转录酶是以mRNA为模板合成互补DNA即 cDNA，用于组建cDNA基因文库。

T４多核苷酸激酶能催化ATP的γ-磷酸
基因组DNA文库(genomic DNA library)
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段， 分别与适合的载体重组后导入宿主细胞，这些重组 分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列。 这种通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中的各种 DNA重组分子的集合体称为基因组DNA文库。
构建基因组DNA文库的过程
命
名：
第一个字母代表细菌的属名，用大写； 第二、三个字母是该细菌种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 EcoRⅠ E=Eschrichia属
co=coli种
R=RY13菌株
Ⅰ =发现的第一个限制酶
限制性内切核酸酶
Ⅱ型限制酶识别序列特点 ———回文结构
EcoRⅠ的切割位点
（二）目的基因与载体的连接
1.同源粘性末端连接 2.平端连接
3.定向连接
1. 同源粘性末端连接
方式：同一限制酶切割位点连接配伍末 端连接
2. 平端连接
适用于：限制性内切酶产生的平端切割 粘性未端或切平形成的平端
3. 定向连接
适用于：两种不同的粘性末端 一个粘端，一个平端
目的基因与载体的连接