第八章 生物工程育种
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第八章 基因工程育种
第一节、转基因研究概况
一、意义：
自 80 年代 Palmiter 等将外源生长激素（ GH ）基因导入小鼠
获得快速生长的超级小鼠以来，应用转基因技术获得具有速 生、抗病、优质等性状的优良品种引起了人们的极大兴趣， 相继开展了兔、鱼、鸡、猪、羊等动物的基因转移。
转基因动物研究已成为一个极具潜在价值的生物医学研究新
（3）基因下调（knock-down）
RNA干扰（RNA interference，RNAi）又被称为基因下调， 通过干扰RNA（smallinterference siRNA）分子的作用达到 转录后基因沉默的效应。 siRNA的制备方法主要包括体外合成siRNA和siRNA表达载体 两种。体外合成的siRNA易转染细胞，进入细胞后，可直接发 挥作用，一般不存在siRNA 表达载体的转录效率低及细胞毒性 等问题。但是体外合成的siRNA 只能瞬间干扰，不能达到长久 抑制病毒的效果。
3 .定向打靶载体
基因打靶是通过外源基因与靶细胞染色体上的同源序列间的
同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞特定位置上，而使
某一个特定位点上的基因发生定点突变的技术。
在细胞内存在两条相同的DNA链（同源染色体），在细胞内
酶的作用下，可以将其切开，发生交叉，然后重新连接，从 而发生DNA链的交换并引发重组。
启动子
同源序列
Neo
同源序列
HSV-TK
同源重组
随机整合
把细胞注入胚泡
把胚胎注入 假孕小鼠
Southern印记
（ +/） （ +/）
（+/-）
（ +/+ ） （ +/+ ）
） （（ +/--/）
（+/-） （+/-） （-/-）
（1）基因敲除（knock-out）
敲除型载体由两段与基因组内靶基因座序列同源的 DNA 片段（又称同源臂）组成，中间为正向选择标记， 同缘臂外侧为真核细胞中的负选择标记及在原核细胞中 进行复制与筛选的载体DNA序列。
（2）腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）
腺相关病毒是一种天然复制缺陷型非致病性单链DNA病毒， 其复制需要有辅助病毒的共转染。无共转染时，野生型AAV优 先（70%）整合在人染色体的19q13.3位点处，潜伏存在直至被
辅助病毒拯救出来。其整合需要基因组两端的ITR，以及非结
(1)基因敲除的基本程序
构建打靶载体
neor HSV-tk
1）同源序列
2） 打靶载体常含两种筛选标志 后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。 HSV-tk：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，阴 性筛选标志， 该基因产物可分解单核苷酸类似物 而生成毒性产物，产生自杀效果。
neor ：新霉素抗性基因，阳性筛选标志。当重组
六、转基因植物
第二节 转基因动物技术
一、动物基因工程载体 二、基因转移技术
基因工程技术路线
（一）DNA片段的获得
1、从基因所在的生物体直接取得
限制性内切酶（restriction enzymes）
2、人工合成DNA片段（DNA合成仪） 3、PCR反应合成DNA 4、 mRNA反转录成cDNA，RACE技术
领域。外源基因的导入已成为研究基因调控、发育分化、组 织特异表达、培育生物新品种的一个有力手段，其发展潜力 和应用前景受到广泛的重视。
1、转生长激素
世界第一只转基因动物
转基因“硕鼠”（右）
转基因鱼
转基因牛
转基因猪
2. 动物生物反应器
转基因动物的出现引导人们试图把转基因动物作为
一种生物反映器，生产人类所需的医用珍贵稀有蛋
6、精子载体法
1.物理转染法
（1）电击法（ electroporation）其 基本原理是在外加电 场的作用下，细胞膜 电位发生改变，细胞 质膜瞬间出现可逆性 的电穿孔，从而使一 定数量的外源DNA从 细胞外扩散到细胞质 和细胞核内，并进一 步整合到宿主DNA上 ，达到转基因目的。
（2）显微注射法
作为基因转移的病毒载体须具备以下基本条件：
携带外源基因并能够包装成病毒颗粒
介导外源基因的转移与表达
对机体不致病
（1）腺病毒（adenovirus）
腺病毒作为转染载体有许多特点： • 基因组的重排率低 • 外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个 周期 • 安全性好，不会整合到人的染色体上， 不导致肿瘤的发生 • 宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂 期要求不高 • 外源基因在载体上容易高效表达
为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了 含有位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件 ，可以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。 LCR和MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插 入什么位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基 因的表达。 基因打靶技术的出现与发展，实现了对目的基因的定位 操作。
等新的生产性状，改良养殖品种的品质。
另一方面的研究目的是利用转基因手段解决发育生物学和分
子生物学问题。
如Du等采用美洲大绵尉抗冻蛋白启动子－鲑鱼生长激素
cDNA，将其转移进鲑鱼，成功地获得了比对照生长速率快4
－6倍的转基因鱼，最大为对照的13倍（Du,et al.,1992）。如
Ozato等研究了鸡 以及表达与发育过程的相关性（Ozato,et al.,1986）。还有研 究不同启动子基因重组体在转基因鱼中的表达特性，以及一 些在发育和生理上重要的基因（如生长激素基因）在发育中 的调控作用（Stuart,et al.,1988; McEvoyg,et al.,1988）。
5、基因组文库和cDNA文库
Genome DNA
Total RNA
（二）动物基因工程载体
质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体
1 .质粒型表达载体
表达载体的共同特点是都带有原核复制区和选择性
标记基因，保证重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增
，同时也必须包括能在真核细胞表达的相关组件。一般 包括转录外源DNA序列的启动元件、转录产物有效地 加上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核细胞中的 选择性标记，另外还增加了一些附加元件，如增强子、
，并能稳定遗传。
三、基因工程技术路线
1、DNA片段的取得（目的基因 的分离和制备）
2、DNA片段和载体的连接—— 重组体DNA 3、外源DNA片段引入受体细胞 ——基因克隆和基因文库 4、选择基因（目的基因） 5、目的基因表达
切
接
转
选 表达
四、发展的趋势
1、从简单的显微注射法向高效率的转 基因体细胞核移植方向发展
是将外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过玻璃 微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使 外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。
胚胎干细胞基因转化法 (引自G1ick & Pasternak，1998)
（3）基因枪法
基本原理是将要转染的DNA吸附到高黏度 的金属（钙或金等）颗粒上，在一种加速装置 的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内 ，达到转基因目的 （4）超声波法（sonoporation） 超声波增强基因转染法的主要机制是声波的空 化效应导致细胞的通透性增高，而通过添加超生 造影剂能降低空化域值，增强空化效应，促进外 源基因进入细胞，提高基因的转染效果
五、水生动物的转基因研究 水生动物方面的转基因研究，目前主要集中在转基因鱼的研
究上。从1985年朱作言等报道了转基因鱼的工作以来，已将
多种外源基因导入鲑鱼、鳟鱼、斑马鱼等。
研究的目的主要有两方面：
一是进行诸如生长激素（GH）基因 、抗冻蛋白（AFP）基
因、病毒外壳蛋白基因等外源基因转基因动物研究，旨在通 过外源基因的转移，使养殖动物获得抗冻、抗病、生长快速
３、从传统转基因到条件控制的转变
从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历了两个阶段：
第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶
段。 借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入高等动物的 基因组，或将目的基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系 间基因转移或修饰，产生新的基因型和表型。 目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、 动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等５个方面。
（2）基因敲入（knock-in）
基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色体
的特定位点上。基因敲入的转基因结构设计上相似于基因敲 除结构，但区别在于： 或用外源基因替换并失活靶基因 或在不影响原基因功能的前提下插入新的基因 或在染色体上特定位点插入新的外源基因，从而实现基因转 移，并使得外源基因高效表达
构基因编码的蛋白Rep78 和Rep68的存在。
AAV具有以下几个方面特点：
非致病性、无免疫原性和无炎症反应
能感染静止期的细胞，如神经元细胞
插入的外源基因表达时间长，一般能够达到1年之多 宿主范围广 热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化
（3）反转录病毒
反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，感染宿主细胞后，病毒
大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping)
精细突变的引入 打了就走策略 (Hit and Run 法) 双置换法 (Double Replacement) “标记和置换”法 (Tag and Exchange)
利用Cre-LoxP系统引入点突变
条件性基因打靶 时空特异性基因打靶（spatiotemporal gene targeting STGT
——-安迪
4、表达调控、观赏
二、基因工程的概念 genetic engineering
定义： 又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片
断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受 体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。
目的: 是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状
从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法外，人们先后试过
反转录病毒载体介导法、精子介导法、胚胎干细胞介导法和核移植 法等多种转基因方法。
转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生产的主流方法。
2、从外源基因随机插入（或整合）到 定点整合的转变
转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定
点整合。
内含子、剪接供体与受点，以保证外源基因的高效表达
。
重组质粒构建
载体是指携带靶DNA片段进入宿主细
胞进行扩增和表达的工具。
质粒是指一种存在于细胞内能独立复
制的染色体外的 DNA。
1)质粒图谱登记号：0052 2)质粒名称：pBudCE4.1 3)来源：Invitrogen 4)用途：真核表达载体 5) 详细资料 6)是否可以共享 7)联系方式：PM
重组质粒的构建过程
重组基因的鉴定
(1)抗性筛选法：能否生长；蓝色和白色菌
落，其Biblioteka Baidu白色菌落可能含重组质粒。
(2)PCR：
(3)双酶切：
体外表达
* 在原核生物中的表达：细菌、酵母
在真核生物细胞中的表达：人工培养肝细胞、上皮细胞
人工培养的人成骨细胞
人成骨细胞内的pEGFP蛋白表达
2. 病毒载体
颗粒中的pol基因表达出反转录酶，以单链的RNA基因组为模板， 立即转录出一份线形双链DNA复本，然后在整合酶（Int）介导下 ，整合到宿主的基因组内，此时整合的病毒序列被称为前病毒。
反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其DNA随宿主DNA
的复制而复制，并由5`-LTR中的一个强启动子转录出病毒RNA链 ，它既是病毒基因组，同时又具有mRNA模板活性，翻译出结构 蛋白和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同的RNA链和反转录 酶被包装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒以芽植方式分泌至细胞 外，但通常不致死宿主细胞。
）
Cre/LoxP和FLP—frt系统
染色体组大片段的删除和重排
（三）、基因转移技术
物理转染法 化学转染法 生物法
基因转移技术的进展 1、DNA显微注射法 2、反转录病毒载体支持的基因转移 3、电脉冲法 4、利用转化的全能胚胎干细胞形成生殖系嵌合体的基因转移 5、介导法：脂质体介导、钙离子介导、PEI(polyethylenmine)
白，特别是医用活性肽。
乳汁中分泌人凝血因 子IX的转基因山羊
能生产人促红细胞生 成素的转基因牛
3. 异种器官移植
英国苏格兰罗斯林研 究中心培育出的5只 转基因小猪
通过基因工程的手术， 将猪的一个基因—— —阿尔法1号(GT基 因)“关闭”
第一只商业化转基因羊
世界首只转基因灵长类动物
分泌α—抗胰蛋白酶
第一节、转基因研究概况
一、意义：
自 80 年代 Palmiter 等将外源生长激素（ GH ）基因导入小鼠
获得快速生长的超级小鼠以来，应用转基因技术获得具有速 生、抗病、优质等性状的优良品种引起了人们的极大兴趣， 相继开展了兔、鱼、鸡、猪、羊等动物的基因转移。
转基因动物研究已成为一个极具潜在价值的生物医学研究新
（3）基因下调（knock-down）
RNA干扰（RNA interference，RNAi）又被称为基因下调， 通过干扰RNA（smallinterference siRNA）分子的作用达到 转录后基因沉默的效应。 siRNA的制备方法主要包括体外合成siRNA和siRNA表达载体 两种。体外合成的siRNA易转染细胞，进入细胞后，可直接发 挥作用，一般不存在siRNA 表达载体的转录效率低及细胞毒性 等问题。但是体外合成的siRNA 只能瞬间干扰，不能达到长久 抑制病毒的效果。
3 .定向打靶载体
基因打靶是通过外源基因与靶细胞染色体上的同源序列间的
同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞特定位置上，而使
某一个特定位点上的基因发生定点突变的技术。
在细胞内存在两条相同的DNA链（同源染色体），在细胞内
酶的作用下，可以将其切开，发生交叉，然后重新连接，从 而发生DNA链的交换并引发重组。
启动子
同源序列
Neo
同源序列
HSV-TK
同源重组
随机整合
把细胞注入胚泡
把胚胎注入 假孕小鼠
Southern印记
（ +/） （ +/）
（+/-）
（ +/+ ） （ +/+ ）
） （（ +/--/）
（+/-） （+/-） （-/-）
（1）基因敲除（knock-out）
敲除型载体由两段与基因组内靶基因座序列同源的 DNA 片段（又称同源臂）组成，中间为正向选择标记， 同缘臂外侧为真核细胞中的负选择标记及在原核细胞中 进行复制与筛选的载体DNA序列。
（2）腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）
腺相关病毒是一种天然复制缺陷型非致病性单链DNA病毒， 其复制需要有辅助病毒的共转染。无共转染时，野生型AAV优 先（70%）整合在人染色体的19q13.3位点处，潜伏存在直至被
辅助病毒拯救出来。其整合需要基因组两端的ITR，以及非结
(1)基因敲除的基本程序
构建打靶载体
neor HSV-tk
1）同源序列
2） 打靶载体常含两种筛选标志 后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。 HSV-tk：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，阴 性筛选标志， 该基因产物可分解单核苷酸类似物 而生成毒性产物，产生自杀效果。
neor ：新霉素抗性基因，阳性筛选标志。当重组
六、转基因植物
第二节 转基因动物技术
一、动物基因工程载体 二、基因转移技术
基因工程技术路线
（一）DNA片段的获得
1、从基因所在的生物体直接取得
限制性内切酶（restriction enzymes）
2、人工合成DNA片段（DNA合成仪） 3、PCR反应合成DNA 4、 mRNA反转录成cDNA，RACE技术
领域。外源基因的导入已成为研究基因调控、发育分化、组 织特异表达、培育生物新品种的一个有力手段，其发展潜力 和应用前景受到广泛的重视。
1、转生长激素
世界第一只转基因动物
转基因“硕鼠”（右）
转基因鱼
转基因牛
转基因猪
2. 动物生物反应器
转基因动物的出现引导人们试图把转基因动物作为
一种生物反映器，生产人类所需的医用珍贵稀有蛋
6、精子载体法
1.物理转染法
（1）电击法（ electroporation）其 基本原理是在外加电 场的作用下，细胞膜 电位发生改变，细胞 质膜瞬间出现可逆性 的电穿孔，从而使一 定数量的外源DNA从 细胞外扩散到细胞质 和细胞核内，并进一 步整合到宿主DNA上 ，达到转基因目的。
（2）显微注射法
作为基因转移的病毒载体须具备以下基本条件：
携带外源基因并能够包装成病毒颗粒
介导外源基因的转移与表达
对机体不致病
（1）腺病毒（adenovirus）
腺病毒作为转染载体有许多特点： • 基因组的重排率低 • 外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个 周期 • 安全性好，不会整合到人的染色体上， 不导致肿瘤的发生 • 宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂 期要求不高 • 外源基因在载体上容易高效表达
为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了 含有位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件 ，可以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。 LCR和MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插 入什么位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基 因的表达。 基因打靶技术的出现与发展，实现了对目的基因的定位 操作。
等新的生产性状，改良养殖品种的品质。
另一方面的研究目的是利用转基因手段解决发育生物学和分
子生物学问题。
如Du等采用美洲大绵尉抗冻蛋白启动子－鲑鱼生长激素
cDNA，将其转移进鲑鱼，成功地获得了比对照生长速率快4
－6倍的转基因鱼，最大为对照的13倍（Du,et al.,1992）。如
Ozato等研究了鸡 以及表达与发育过程的相关性（Ozato,et al.,1986）。还有研 究不同启动子基因重组体在转基因鱼中的表达特性，以及一 些在发育和生理上重要的基因（如生长激素基因）在发育中 的调控作用（Stuart,et al.,1988; McEvoyg,et al.,1988）。
5、基因组文库和cDNA文库
Genome DNA
Total RNA
（二）动物基因工程载体
质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体
1 .质粒型表达载体
表达载体的共同特点是都带有原核复制区和选择性
标记基因，保证重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增
，同时也必须包括能在真核细胞表达的相关组件。一般 包括转录外源DNA序列的启动元件、转录产物有效地 加上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核细胞中的 选择性标记，另外还增加了一些附加元件，如增强子、
，并能稳定遗传。
三、基因工程技术路线
1、DNA片段的取得（目的基因 的分离和制备）
2、DNA片段和载体的连接—— 重组体DNA 3、外源DNA片段引入受体细胞 ——基因克隆和基因文库 4、选择基因（目的基因） 5、目的基因表达
切
接
转
选 表达
四、发展的趋势
1、从简单的显微注射法向高效率的转 基因体细胞核移植方向发展
是将外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过玻璃 微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使 外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。
胚胎干细胞基因转化法 (引自G1ick & Pasternak，1998)
（3）基因枪法
基本原理是将要转染的DNA吸附到高黏度 的金属（钙或金等）颗粒上，在一种加速装置 的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内 ，达到转基因目的 （4）超声波法（sonoporation） 超声波增强基因转染法的主要机制是声波的空 化效应导致细胞的通透性增高，而通过添加超生 造影剂能降低空化域值，增强空化效应，促进外 源基因进入细胞，提高基因的转染效果
五、水生动物的转基因研究 水生动物方面的转基因研究，目前主要集中在转基因鱼的研
究上。从1985年朱作言等报道了转基因鱼的工作以来，已将
多种外源基因导入鲑鱼、鳟鱼、斑马鱼等。
研究的目的主要有两方面：
一是进行诸如生长激素（GH）基因 、抗冻蛋白（AFP）基
因、病毒外壳蛋白基因等外源基因转基因动物研究，旨在通 过外源基因的转移，使养殖动物获得抗冻、抗病、生长快速
３、从传统转基因到条件控制的转变
从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历了两个阶段：
第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶
段。 借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入高等动物的 基因组，或将目的基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系 间基因转移或修饰，产生新的基因型和表型。 目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、 动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等５个方面。
（2）基因敲入（knock-in）
基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色体
的特定位点上。基因敲入的转基因结构设计上相似于基因敲 除结构，但区别在于： 或用外源基因替换并失活靶基因 或在不影响原基因功能的前提下插入新的基因 或在染色体上特定位点插入新的外源基因，从而实现基因转 移，并使得外源基因高效表达
构基因编码的蛋白Rep78 和Rep68的存在。
AAV具有以下几个方面特点：
非致病性、无免疫原性和无炎症反应
能感染静止期的细胞，如神经元细胞
插入的外源基因表达时间长，一般能够达到1年之多 宿主范围广 热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化
（3）反转录病毒
反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，感染宿主细胞后，病毒
大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping)
精细突变的引入 打了就走策略 (Hit and Run 法) 双置换法 (Double Replacement) “标记和置换”法 (Tag and Exchange)
利用Cre-LoxP系统引入点突变
条件性基因打靶 时空特异性基因打靶（spatiotemporal gene targeting STGT
——-安迪
4、表达调控、观赏
二、基因工程的概念 genetic engineering
定义： 又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片
断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受 体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。
目的: 是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状
从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法外，人们先后试过
反转录病毒载体介导法、精子介导法、胚胎干细胞介导法和核移植 法等多种转基因方法。
转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生产的主流方法。
2、从外源基因随机插入（或整合）到 定点整合的转变
转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定
点整合。
内含子、剪接供体与受点，以保证外源基因的高效表达
。
重组质粒构建
载体是指携带靶DNA片段进入宿主细
胞进行扩增和表达的工具。
质粒是指一种存在于细胞内能独立复
制的染色体外的 DNA。
1)质粒图谱登记号：0052 2)质粒名称：pBudCE4.1 3)来源：Invitrogen 4)用途：真核表达载体 5) 详细资料 6)是否可以共享 7)联系方式：PM
重组质粒的构建过程
重组基因的鉴定
(1)抗性筛选法：能否生长；蓝色和白色菌
落，其Biblioteka Baidu白色菌落可能含重组质粒。
(2)PCR：
(3)双酶切：
体外表达
* 在原核生物中的表达：细菌、酵母
在真核生物细胞中的表达：人工培养肝细胞、上皮细胞
人工培养的人成骨细胞
人成骨细胞内的pEGFP蛋白表达
2. 病毒载体
颗粒中的pol基因表达出反转录酶，以单链的RNA基因组为模板， 立即转录出一份线形双链DNA复本，然后在整合酶（Int）介导下 ，整合到宿主的基因组内，此时整合的病毒序列被称为前病毒。
反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其DNA随宿主DNA
的复制而复制，并由5`-LTR中的一个强启动子转录出病毒RNA链 ，它既是病毒基因组，同时又具有mRNA模板活性，翻译出结构 蛋白和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同的RNA链和反转录 酶被包装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒以芽植方式分泌至细胞 外，但通常不致死宿主细胞。
）
Cre/LoxP和FLP—frt系统
染色体组大片段的删除和重排
（三）、基因转移技术
物理转染法 化学转染法 生物法
基因转移技术的进展 1、DNA显微注射法 2、反转录病毒载体支持的基因转移 3、电脉冲法 4、利用转化的全能胚胎干细胞形成生殖系嵌合体的基因转移 5、介导法：脂质体介导、钙离子介导、PEI(polyethylenmine)
白，特别是医用活性肽。
乳汁中分泌人凝血因 子IX的转基因山羊
能生产人促红细胞生 成素的转基因牛
3. 异种器官移植
英国苏格兰罗斯林研 究中心培育出的5只 转基因小猪
通过基因工程的手术， 将猪的一个基因—— —阿尔法1号(GT基 因)“关闭”
第一只商业化转基因羊
世界首只转基因灵长类动物
分泌α—抗胰蛋白酶