多重PCR技术

多重PCR技术在植物病毒检测中温度 的确定
三、多PCR条件优化
❖ 多重PCR是在传统PCR基础上改进并发展起 来的，但并不是单一PCR的简单混合，在实 际操作中常常受到反应条件和反应体系等多 种因素的影响。
1、反应体系优化原则
❖ 1、确保所有的靶位点可以用相同的PCR程序 在单个反应中得到有效的扩增；
五、多重PCR技术在食品中的应用
❖ 多重PCR在食品安全检测中的应用 ❖ 多重PCR技术在肉品致病菌检测中的应用 ❖ 应用多重PCR技术检测肉品中的致病菌主要
是根据该菌的特异性基因设计出合适的引物， 对基因的高度保守区进行扩增。
❖ 对肉品中单一病原菌的检测
❖ 对于血清型较为复杂的病原细菌，如沙门氏 菌，致病性大肠杆菌等，采用传统PCR检测 单一基因片段，特异性不高，影响检测样品 的有效性。多重PCR技术针对病原菌多个高 度保守的基因序列设计引物进行扩增，提高 特异性，减少假阳性。
一、多重PCR技术原理
❖ PCR是什么：聚合酶链式反应。是一种体外快速扩增特定基 因或DNA片段的分子生物学技术。
❖ NTP(脱氧核苷三磷酸) 、适当缓冲液Mg2+的混合体系中， 在DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，对引物所 界定的DNA片段进行扩增。这种扩增通过模板DNA与引物之 间的变性、退火和延伸三个步骤为一循环，每次循环产生的 DNA片段作为下次 循环的模板，所以PCR扩增产物呈指数 增加。多重PCR是在传统PCR原理的基础上进行改进，即在 同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模 板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。
存在问题和技术展望
❖ 多重PCR在实际应用中一旦有极少量外源性 DNA污染，就可能出现假阳性结果：多对引 物同时扩增，各种试验条件控制不当，很容 易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设 计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏 度和特异性。此外，对食品样品进行检测时， 增菌培养基选择不当易使有的细菌生长缓慢 或被抑制，导致假阴性的结果。
3、模板核酸的量
❖ 模板核酸的量和纯度是PCR成败的关键环节 之一。模板量太少，会出现阴性结果或条带 很弱；模板量太多则会出现条带弥散，模糊 不清；模板纯度低或被降解会导致扩增的不 整齐。模板核酸片段还必须具有高度的特异 性，以避免非特异性扩增，保证检测的准确 性。另外，各片段长度应具有明显差异，以 有利于扩增后产物的区分。
多重PCR技术在病原检测中的应用
❖ 应用多重PCR方法对感染性疾病病原检测上 要有两个方法：一是针对每一种病原的单个 特异基因进多重检测，同时检测一种或几种 病原体的存在与否；一是针对某一病原的多 个基因进行多重检测，可以减少假阳性结果 的出现。
❖ 可系统组合的有：
❖ ①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内， 有时存在多种肝炎病毒重叠感染，如：甲、乙、丙 型肝炎病毒重叠，甲、乙型肝炎病毒重叠，已、丙 型肝炎病毒重叠等；②肠道敛病性细菌的检测，如 伤寒、痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状， 有时痢疾、霍乱同一个病人并同时发病；④性传播 疫病：梅毒、淋病及艾滋病的检测；④战伤细菌及 生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌、产气荚膜杆 菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌等的质检。
域 ❖ 转基因检测则选择转入的动植物基因座 ❖ 性别鉴定一般挑选X或Y性染色体上特有的基因座
❖ 第二、引物的设计（关键步骤） ❖ 1、引物位置的确定：首先需要知道所选择的基因
引物位点的详细DNA序列信息。 ❖ 引物的DNA序列应该有很强的特异性，否则引物会
结合在其他位点上发生非特异性扩增。 ❖ 2、引物序列的测定：引物的设计是多重PCR成功
❖ 多重PCR的退火时间比传统PCR稍微延长， 有助于引物与模板的完全结合。延伸时间则
要根据模板核酸的长度决定。黄银花等经过 反复的优化实验发现，多重PCR的延伸时间 比传统PCR循环时延伸时间为40s长，他们 认为循环时延伸时间为1min的扩增效果好， 扩增产物加尾整齐。
5、反应体系优化
❖ 由于多重PCR体系中加入多对引物，因此反应体积和反应体 系中的各成分也应做相应的调整。有学者通过实验认为， 20uL与15uL的反应体积能达到多重PCR扩增要求，并同时 对PCR缓冲液进行了改进，认为多重PCR理想的缓冲液为： 1.5mmol／LMgCl，50mmol／L KCl，10mmol／L HCl pH=8.3，1mmol／L TMAC，0.01％明胶。同时有研究表明， Mg2+浓度与dNTP浓度有相关性，对于一个25uL的反应体系， 当Mg2+浓度为1.5mmol／L时，dNTP推荐浓度为200 u mol ／L。多重PCR反应体系中，不同的反应会不同程度的竞争 DNA聚合酶，因此在反应体系中适当多加入一些DNA聚合酶， 可获得更佳的扩增效果。
4、循环参数的优化
❖ 在传统PCR反应中，一个体系通常采用一个 退火温度。在多重PCR体系中，不同长度的 模板核酸片段、不同的引物对所要求的退火 温度不一样。黄银花等人通过研究证实，在 15 u L的反应体系中含有多个退火温度的多 重PCR反应条件的扩增效果比采用一个退火 温度的效果好，基本能满足多重PCR的要求。 一般来说，在解链温度Tm值允许范围内，选 择较高的退火温度。
的重要保证：事先通过GDB（基因数据库）、 NCBI（生物技术信息中心）查引物相关位点的DNA 序列信息。 ❖ 3、引物序列的比较：引物间连续互补不能超过4bp， 以防止发生交叉错配。
❖ 第三、多重PCR反应条件的确定：
❖ 首先进行单个PCR，分别设定各引物对反应 条件。然后，依次增加引物对，不断调整反 应条件直至最后保证所有的引物对都能在同 一条件下扩增出目的条带。
二、多重PCR实验设计：大致的如何 操作
❖ 所要求的东西主要是：菌株、培养基、供试 药物、试剂
❖ 培养基：分离培养基、增菌培养基
❖ 主要试剂：Taq DNA聚合酶，dNTPs ❖ 主要仪器：PCR仪、恒压恒流电泳仪、凝胶
成像仪、常温离心机、浴式振荡器、电热恒 温水浴锅等等
❖ 操作方法：第一、多重PCR扩增区域的选择 ❖ 由分析目的来决定：缺失分析选择扩增外显子 ❖ 法医学鉴定个体差异选择扩增高度多态性标志 ❖ 微生物鉴别分析可能利用种或株DNA特异性变化区
❖ 今后的技术发展尚需延伸： ❖ (1)DNA模板的提取和纯化方法。 ❖ (2)反应条件的优化。 ❖ (3)增加反应引物对数，真正实现高通量。 ❖ (4)与其他分子生物学技术相结合。
四、多重PCR的结果分析
❖ 某些多重PCR系统，特别是那些鉴别点突变 或其他微小变化的系统，其PCR产物除琼脂 糖电泳外，还需要进一步的分析。许多已建 立的单个PCR产物分析技术可以直接应用于 多重PCR分析，如限制性内切酶消化、放射 性探针杂交、毛细管电泳和单链构象多态性 （SSCP）分析都可以用来做多重PCR产物 的常规分析。
❖ 2、在使用相同的PCR程序和反应条件的单个 PCR中对每对引物的量进行优化，以达到最 大的扩增效率；
❖ 3、平衡多重PCR中每对引物的量，使之对每 个靶点都能获得足够的扩增量。
2、引物设计（关键优化）
❖ 多重PCR中的每对引物必须满足单引物PCR体系的 引物设计原则。这些原则包括：引物与模板的序列 紧密互补，长度一般为15—30bp，GC含量一般为 40—60％；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体 或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反应(即错配)。由于多重PCR体系中同时 存在多对引物，在引物设计时还应注意：各引物对 必须保持高度的特异性，避免非特异扩增；尽可能 避免所有引物间的相互作用，各引物对应保持相对 一致的扩增效率，且不同引物对扩增出来的产物能 通过电泳或其他方法区分开。
多重PCR技术
讲解框架
❖ 第一、多重PCR技术原理 ❖ 第二、多重PCR实验设计：大致的如何操作 ❖ 1、 多重PCR扩增区域的选择 ❖ 2、 引物的设计（关键步骤） ❖ 3、多重PCR反应条件的确定 ❖ 第三、多重PCR条件优化 ❖ 1、反应体系优化 ❖ 2、引物设计 ❖ 3、模板核酸质量 ❖ 4、循环参数优化 ❖ 第四、多重PCR技术结果分析 ❖ 第五、多重PCR技术在食品中的应用