多肽从头测序方法
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• 缺点：遇到两种以上蛋白混合物或者分子量小于20 KD蛋白很难测定， 并且严重依赖数据库。
图. BSA的肽质量指纹图谱
Edman降解
• 将多肽或者蛋白的N-末端第一个氨基酸修饰上异硫氰酸苯酯，使之脱 落并测定。重复该过程，可从N-末端依次得到多肽或蛋白的序列。
• 缺点：速度慢，成本高，测蛋白内部序列较麻烦。
多肽从头测序方法
安明瑞 2011年10月17日
主要内容
• 背景 • 多肽从头测序 • 我们改进的多肽从头测序方法及应用 • 总结
多肽测序方法
多肽不断裂
•
化学或酶切断裂
多肽质量指纹谱图（PMF） Edman降解
羧肽酶法
质谱断裂
CID ETD
数据库检索谱图 多肽从头测序
多肽质量指纹谱图
• 蛋白质在某种特定的酶（一般是胰蛋白酶）的酶切作用下，会形成一 组多肽，而这一组多肽对应了一组分子量。不同蛋白质在酶切后会产 生不同的一组多肽，对应不同的一组分子量。因此，可以通过质谱测 得的一组分子量来确定究竟是什么蛋白。
Ri
R i+1
R i+2
R i+3
bi
bi+1
bi+2
图. 利用碎片离子的 质量差，无法得知对 应的氨基酸残基。
常规数据库检索的步骤
理论酶切
•
理论碎裂，并根据与二级谱 图中碎片离子匹配情况打分
根据母 离子分 子量筛 选
数据库检索结果
序列: GWGPHCEICPFQGTVAFK
图. 利用二级谱图数据库检索得到多肽序列
简化的二级谱图
yn-i
yn-i-1
yn-i-2
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-
Ri
R i+1
R i+2
R i+3
bi
bi+1
bi+2
图. 利用碎片离子的质 量差，可以得知对应 的氨基酸残基，即多 肽从头测序技术。
正常的二级谱图
yn-i
yn-i-1
yn-i-2
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-
根据母离子的筛选和碎片离子的打分，在数据库里找到一个与该二级 谱图匹配度最高的多肽序列 缺点：是不能分析数据库里没有的多肽、蛋白
数据库检索的缺陷
• 是不能分析数据库里没有的多肽、蛋白包 括以下几种情况：
• 1. 基因组未测序的非模式生物的蛋白 • 2. 数据库里没有的模式生物的蛋白突变体 • 3. 模式生物中由于信使RNA非特异性剪切或蛋白编辑产生
多肽骨架上可能的碎裂位置
xn-i yn-i
yn-i-1
yn-i-2
zn-i
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-
Ri
ai bi ci
R i+1
bi+1
R i+2
R i+3
bi+2
图. 多肽骨架上有三种 断裂可能，a，b，c为 多肽N末端离子，x，y， z为多肽C末端离子。
CID与ETD
图. 多肽CID与ETD的示意图 引自Coon, J.J. Collisions or Electrons? Protein Sequence Analysis in the 21st Century. Analytical Chemistry 81, 3208-3215 (2009)
• -C16O16OH -C18O16OH
-C18O18OH
• 因此，该肽段碎裂后，C-末端碎片离子的 有更多的同位素峰，容易识别。
钠离子-多肽的多级质谱
• 多肽在电喷雾离子化过程如果结合的不是氢离子而是Na+ 离子，则CID条件下，其碎裂往往只发生在多肽C-末端最 后一个氨基酸残基上。多次进行碎裂（多级质谱）则可以 从C-末端依次测得其氨基酸残基。
的未报到的蛋白
多肽从头测序的优、缺点
• 优点： • 可以得到所有物种的多肽、蛋白序列，不
论之前是否被报道过。
• 缺点： • 可信度很低，因此没有被广泛使用
多肽从头测序策略可信度低的原因
• 1. 不同系列的离子叠加在二级质谱谱图上
• 原因：多肽碎裂时产生N-端与C-端两种系列的离子
图. 多肽DAFLGSFLYEYSR的CID二级谱图
我们的研究目的
• 实现高可信度的多肽从头测序
多肽N-末端衍生
• 负电荷衍生 • 在多肽N-末端引入一个磺酸基团，可以大大降低
二级谱图中多肽N-末端碎片离子的信号强度，主 要产生C-末端离子（如y离子）系列。 • 正电荷衍生 • 在多肽N-末端引入一个季铵或季膦基团，可以大 大提高二级谱图中多肽N-末端碎片离子的信号强 度，主要产生来自百度文库-末端离子（如b离子）系列。
时间延迟碎裂
• 多肽离子进入线性离子阱后，立即碎裂就会产生复杂的二 级谱图（图A）。
• 如果停留10毫秒以上，一部分多肽离子内能会降低，这些 内能降低的多肽碎裂产生的谱图往往只有y离子（图B）。
图. 引自 Rapid Commun. Mass. Spectrom. 2003, 17, 1389–1398.
图.不同的氨基酸在色谱柱上的洗脱时间不一样，检测脱落氨基酸可根据色谱洗脱时间或者测定分子量。
质谱断裂
• 质谱断裂方法目前有两大类：
• CID
• Collision Induced Dissociation 碰撞诱导裂解
• ETD（或ECD）
• Electron Transfer (Capture) Dissociation 电子转移（捕获） 裂解
• 2. 二级质谱谱图碎片离子信息不足
• 原因：多肽碎裂不完全，有的位置没有断裂
简化二级谱图的处理技术
• 1. 18O标记 • 2. 钠离子-多肽的多级质谱 • 3. 特殊蛋白酶的酶切 • 4. 时间延迟碎裂 • 5. 多肽N-末端衍生
18O标记
• 蛋白在16O与18O混合水中酶解时，产生的 多肽C末端羧基有三种可能
图. 引自 J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2001, 12, 497–504
特殊蛋白酶的酶切
• 使用Lys-N端酶酶切蛋白，产生的多肽其N-末端 第一个氨基酸都是Lys。
• 例如：KSDEFQCCAG，KMPLLWDE等。 • 如果这些多肽不含有其他的碱性氨基酸（Arg或
His），并且只带一个正电荷的话，那么这个正电 荷在这个Lys上面。 • 在MALDI质谱上经过后源裂解（PSD）之后，电 荷仍然只保留在N-末端的b离子上，而C-末端的y 离子不带电，因此二级谱图上只有b离子。
图. BSA的肽质量指纹图谱
Edman降解
• 将多肽或者蛋白的N-末端第一个氨基酸修饰上异硫氰酸苯酯，使之脱 落并测定。重复该过程，可从N-末端依次得到多肽或蛋白的序列。
• 缺点：速度慢，成本高，测蛋白内部序列较麻烦。
多肽从头测序方法
安明瑞 2011年10月17日
主要内容
• 背景 • 多肽从头测序 • 我们改进的多肽从头测序方法及应用 • 总结
多肽测序方法
多肽不断裂
•
化学或酶切断裂
多肽质量指纹谱图（PMF） Edman降解
羧肽酶法
质谱断裂
CID ETD
数据库检索谱图 多肽从头测序
多肽质量指纹谱图
• 蛋白质在某种特定的酶（一般是胰蛋白酶）的酶切作用下，会形成一 组多肽，而这一组多肽对应了一组分子量。不同蛋白质在酶切后会产 生不同的一组多肽，对应不同的一组分子量。因此，可以通过质谱测 得的一组分子量来确定究竟是什么蛋白。
Ri
R i+1
R i+2
R i+3
bi
bi+1
bi+2
图. 利用碎片离子的 质量差，无法得知对 应的氨基酸残基。
常规数据库检索的步骤
理论酶切
•
理论碎裂，并根据与二级谱 图中碎片离子匹配情况打分
根据母 离子分 子量筛 选
数据库检索结果
序列: GWGPHCEICPFQGTVAFK
图. 利用二级谱图数据库检索得到多肽序列
简化的二级谱图
yn-i
yn-i-1
yn-i-2
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-
Ri
R i+1
R i+2
R i+3
bi
bi+1
bi+2
图. 利用碎片离子的质 量差，可以得知对应 的氨基酸残基，即多 肽从头测序技术。
正常的二级谱图
yn-i
yn-i-1
yn-i-2
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-
根据母离子的筛选和碎片离子的打分，在数据库里找到一个与该二级 谱图匹配度最高的多肽序列 缺点：是不能分析数据库里没有的多肽、蛋白
数据库检索的缺陷
• 是不能分析数据库里没有的多肽、蛋白包 括以下几种情况：
• 1. 基因组未测序的非模式生物的蛋白 • 2. 数据库里没有的模式生物的蛋白突变体 • 3. 模式生物中由于信使RNA非特异性剪切或蛋白编辑产生
多肽骨架上可能的碎裂位置
xn-i yn-i
yn-i-1
yn-i-2
zn-i
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-
Ri
ai bi ci
R i+1
bi+1
R i+2
R i+3
bi+2
图. 多肽骨架上有三种 断裂可能，a，b，c为 多肽N末端离子，x，y， z为多肽C末端离子。
CID与ETD
图. 多肽CID与ETD的示意图 引自Coon, J.J. Collisions or Electrons? Protein Sequence Analysis in the 21st Century. Analytical Chemistry 81, 3208-3215 (2009)
• -C16O16OH -C18O16OH
-C18O18OH
• 因此，该肽段碎裂后，C-末端碎片离子的 有更多的同位素峰，容易识别。
钠离子-多肽的多级质谱
• 多肽在电喷雾离子化过程如果结合的不是氢离子而是Na+ 离子，则CID条件下，其碎裂往往只发生在多肽C-末端最 后一个氨基酸残基上。多次进行碎裂（多级质谱）则可以 从C-末端依次测得其氨基酸残基。
的未报到的蛋白
多肽从头测序的优、缺点
• 优点： • 可以得到所有物种的多肽、蛋白序列，不
论之前是否被报道过。
• 缺点： • 可信度很低，因此没有被广泛使用
多肽从头测序策略可信度低的原因
• 1. 不同系列的离子叠加在二级质谱谱图上
• 原因：多肽碎裂时产生N-端与C-端两种系列的离子
图. 多肽DAFLGSFLYEYSR的CID二级谱图
我们的研究目的
• 实现高可信度的多肽从头测序
多肽N-末端衍生
• 负电荷衍生 • 在多肽N-末端引入一个磺酸基团，可以大大降低
二级谱图中多肽N-末端碎片离子的信号强度，主 要产生C-末端离子（如y离子）系列。 • 正电荷衍生 • 在多肽N-末端引入一个季铵或季膦基团，可以大 大提高二级谱图中多肽N-末端碎片离子的信号强 度，主要产生来自百度文库-末端离子（如b离子）系列。
时间延迟碎裂
• 多肽离子进入线性离子阱后，立即碎裂就会产生复杂的二 级谱图（图A）。
• 如果停留10毫秒以上，一部分多肽离子内能会降低，这些 内能降低的多肽碎裂产生的谱图往往只有y离子（图B）。
图. 引自 Rapid Commun. Mass. Spectrom. 2003, 17, 1389–1398.
图.不同的氨基酸在色谱柱上的洗脱时间不一样，检测脱落氨基酸可根据色谱洗脱时间或者测定分子量。
质谱断裂
• 质谱断裂方法目前有两大类：
• CID
• Collision Induced Dissociation 碰撞诱导裂解
• ETD（或ECD）
• Electron Transfer (Capture) Dissociation 电子转移（捕获） 裂解
• 2. 二级质谱谱图碎片离子信息不足
• 原因：多肽碎裂不完全，有的位置没有断裂
简化二级谱图的处理技术
• 1. 18O标记 • 2. 钠离子-多肽的多级质谱 • 3. 特殊蛋白酶的酶切 • 4. 时间延迟碎裂 • 5. 多肽N-末端衍生
18O标记
• 蛋白在16O与18O混合水中酶解时，产生的 多肽C末端羧基有三种可能
图. 引自 J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2001, 12, 497–504
特殊蛋白酶的酶切
• 使用Lys-N端酶酶切蛋白，产生的多肽其N-末端 第一个氨基酸都是Lys。
• 例如：KSDEFQCCAG，KMPLLWDE等。 • 如果这些多肽不含有其他的碱性氨基酸（Arg或
His），并且只带一个正电荷的话，那么这个正电 荷在这个Lys上面。 • 在MALDI质谱上经过后源裂解（PSD）之后，电 荷仍然只保留在N-末端的b离子上，而C-末端的y 离子不带电，因此二级谱图上只有b离子。