植物内生菌防治植物寄生线虫的研究进展_江绪文_李贺勤

・综述与专论・

2014年第9期

生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

植物寄生线虫是重要的植物病原物之一，分布广，种类多，主要包括根结线虫、松材线虫、大豆孢囊线虫、茎线虫及香蕉穿孔线虫等［1］，据不完全统计，全世界每年因寄生线虫造成的农作物经济损失约在1 000亿美元以上［2］。长期以来，广泛使用化学药剂对线虫病害进行防治虽取得较好的效果，但存在高毒、高残留的弊端［3］。近年来，随着人们环保意识的增强和高毒、高残留农药的禁用，生物防治日益受到重视，并且被认为是最具发展前景的防治手段［4］。为此，国内外学者开展了大量的研究工作，对植物寄生线虫有生防潜力的微生物已成为研究的热点［5］。目前从土壤微生物中分离出的被应用到生产实践中的生防菌有阿维链霉菌、芽孢杆菌、淡紫拟青霉等，且由阿维链霉菌开发的高效、低毒、

收稿日期：2014-02-19基金项目：山东省“泰山学者”建设工程专项经费，青岛农业大学高层次人才基金项目（631346）作者简介：江绪文，男，博士，讲师，研究方向：种子科学；E -mail ：mjxw888@ 通讯作者：李贺勤，女，博士，讲师，研究方向：微生物资源利用；E -mail ：hqliaau@

植物内生菌防治植物寄生线虫的研究进展

江绪文 李贺勤

（青岛农业大学农学与植物保护学院，青岛 266109）

摘 要： 植物内生菌作为生物防治中的天然资源菌，已引起越来越多研究者的关注。从植物内生菌的分布和种类、分离培养、活性筛选、活性物质成分以及防治植物寄生线虫的作用机理几方面内容进行综述，并对植物内生菌防治植物寄生线虫的相关问题及发展趋势进行探讨，以期为今后深入开展相关研究提供参考。

关键词： 植物内生菌 植物寄生线虫 生物防治

Advances in the Study of Endophytes to Control Plant

Parasitic Nematodes

Jiang Xuwen Li Heqin

（College of Agronomy and Plant Protection ，Qingdao Agricultural University ，Qingdao 266109）

Abstract : Endophyte as a biocontrol agent of natural resources, has attracted more and more interest of the researchers. In this paper, the types and distribution, methods of isolation, culture and screening, bioactive substances, mechanism of nematicidal endophyte were reviewed, and the problem and possible future direction of nematicidal endophyte were discussed. To provide theoretical reference for correlative research on nematicidal endophyte.

Key words : Endophyte Plant parasitic nematodes Biocontrol

广谱的阿维菌素已进行商业化生产，被广泛应用，发展前景广阔。但近年来从土壤微生物中获得对植物寄生线虫有生防作用菌株的比例逐年下降，而从另一类较新的微生物类群——植物内生菌中分离出对植物寄生线虫有生防作用菌株的研究受到人们的重视，成为分离获得植物寄生线虫生防菌的重要来源。因此，本研究是从植物内生菌的分布和种类、分离培养、活性筛选、活性物质成分以及防治植物寄生线虫的作用机理几方面进行综述，并对植物内生菌防治植物寄生线虫的相关问题及发展趋势进行了探讨，以期为深入开展相关研究提供参考。

1 分布和种类

植物内生菌（Endophyte）指那些在生活史的某一阶段或者全部阶段生活在健康植物组织或器官内

生物技术通报Biotechnology Bulletin2014年第9期8

的真菌、细菌或放线菌，被感染的宿主植物不表现外在症状［6］。在目前研究过的所有植物中均发现内生菌［7，8］，它们存在于植物的根、茎、叶、花、果实等各个部位［9］。目前已报道的内生细菌超过129种（隶属于54个属），内生真菌达到171个属，内生放线菌主要为链霉菌（Streptomyces）、链轮丝菌（Streptoverticillum）、游动放线菌（Antinoplanes）、诺卡氏菌（Nocardia）、小单胞菌（Micromonospora）［10］。可见，植物内生菌在植物体内的分布具有普遍性和多样性的特点，这为开展植物内生菌防治植物寄生线虫的研究提供了有利资源。目前已发现的具有防治植物寄生线虫作用的内生真菌有尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）［11］、菜豆拟茎点霉（Phomopsis phaseoli）、Melanconium betulinum［12］、Geotrichum sp.AL4［13］、球毛壳菌（Chaetomium globosum）［14］等；内生细菌有假单胞菌属（Pseudomonas sp.）［15］、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）［16］、缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）［17］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［18］等；内生放线菌如I07A-01824［19］等。

2 分离培养方法

植物内生菌的分离方法主要有两大类：一类为传统的分离培养方法；另一类为新近发展起来的非培养方法［20］。传统的培养法分离植物内生菌有很大的局限性，主要归因于人们对植物内生菌的认识还不够全面客观，许多内生菌的生长条件还未确定；其次，在筛选过程中，受培养基选择性的限制，很多寄生程度高、与寄主植物密切相关的固有菌会被漏掉。因此，约有90%-99%的环境微生物用传统的培养法无法进行分离［21，22］。但因为传统的培养法能够得到菌株实体，所以在新物种资源的发掘等方面有着不可替代的作用，仍是微生物资源开发利用的主要方法［23］。研究植物内生菌次生代谢产物及其生物活性，多采用传统的分离培养法。由于分离培养法具有局限性，为了获得尽可能多的内生菌，一般采用多种分离培养基对内生菌进行分离。目前，国内学者在分离内生真菌中常用 PDA 培养基、察氏培养基等，为了抑制细菌和其他杂菌的生长，通常还将选择性生长抑制剂加入到分离培养基中［24］；分离内生细菌常用牛肉膏蛋白胨（NA）、Luria-Bertani 培养基（LB）等；分离放线菌常用高氏一号培养基、黄豆粉琼脂培养基等，为防止生长快的菌种阻止或掩盖生长缓慢菌种，营养贫乏的培养基也常用于分离内生菌。在进行植物内生菌群落结构多样性研究及种属鉴定时常用非培养法。

3 活性筛选方法

在植物内生菌杀线虫活性筛选时，一般采用室内离体试验和盆栽测效试验相结合的方法进行。杀线虫毒力测定和孵化抑制活性测定主要是触杀法（浸渍法），即将供试线虫或卵囊放入已配好的内生菌发酵提取物的药液中，经一定时间处理后，在解剖镜下检查线虫死活和被击倒的情况［25，26］或孵化率和线虫卵的发育进度［27-29］。繁殖抑制测定一般采用药剂培养基法、棉球法和培养基喷雾法，这3种方法的不同之处在于药剂培养基法是将药剂与培养基混合制成药剂培养基，然后再往培养基上接种供试线虫［30］；棉球法是将药剂和供试线虫注入培养基的棉球上［31］；而培养基喷雾法是将药液直接喷雾在接种供试线虫的培养基上［32］。忌避活性测定一般采用药剂培养基法和棉球法，这里的药剂培养基法是将培养基配成一定浓度的药剂培养基，待培养基完全凝固后，将药剂培养基和对照培养基分别从各自中间分开，然后对半互换，在培养基上接种菌株，待菌长满平板后在分界线的中央放入脱脂棉球，接种供试线虫，一定时间后分别取药剂培养基和对照培养基分离并计线虫数［26］；而棉球法是在培养皿的中间和边缘分别放置脱脂棉球，中间棉球接种线虫，一边棉球加药液，一边棉球加溶剂做对照，一定时间后分别检查两边棉球上线虫数［31，33］。虽然繁殖抑制测定和忌避活性测定都用到了药剂培养基法和棉球法，但在操作上还是有区别的。利用药剂培养基法进行繁殖抑制测定时，培养皿里的药剂培养基和对照培养基各自是完整的；在进行忌避活性测定时，培养皿里的药剂培养基和对照培养基分别从各自中间分开，然后对半互换。利用棉球法进行繁殖抑制测定时，是将药剂和供试线虫注入培养基的同一个棉球上；在进行忌避活性测定时，是将药剂和供试线虫注入培养基的不同棉球上。盆栽试验一般采用