实时荧光定量PCR原理与分析方法
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the expression level of the target gene. Ct value (20 to 30) “no template” control:only water. “no RTase” control
扩增效率：Primer design and testing
• Specificity, • Length, • GC content, • 3′ end stability, • sequence complexity, • melting temperature, • and location in the target sequence of the primers
• non-specific
pathogen detection, gene expression, mutation detection, SNP detection
fluorophore-labeled oligonucleotides (Taqman)
5´R---Q3´
• Specific • more sensitive and
• binds to the minor groove of dsDNA • non-specific • extension phase of each cycle of qPCR
• hydrolysis probe • specific PCR products • extension phase
蛋白残留
qPCR的实验安排
——反转录实验的重要性
Reverse Transcription Protocol：
20μl反转录体系 20μl定量体系
RNA样品 Total RNA: 100ng-1μg
gDNA去除后 的RNA
cDNA 5×-10×稀释
qPCR 1-2μl稀释液
1A. 逆转录酶对cDNA产量的影响
实验分组：Jurkat cells were untreated or treated with PMA. Introdution: TNF in Jurkat cells is very low level.
Calculation of TNF expression levels in Jurkat cells using the ΔΔCT method
问题3：重复性差
• 参考CT值可信度——仪器设置
• 考虑移液误差
1. 移液器失准 2. 模板浓度过低 3. 移液体积过小 4. 试剂、体系未彻底解冻、混匀
重复性较理想的扩增曲线 STD＜0.2
内容概要
1
荧光定量PCR概述
2
实验安排
3
常见问题
4
难点解答
Calculation of TNF expression levels in Jurkat cells using the ΔΔCT method
Primer3 Primer-BLAST mFold secondary structure of primers
determines
amplicon length, melting temperature and amplification efficiency
内容概要
1
荧光定量PCR概述
2
实验安排
3
常见问题
4
难点解答
问题1：非特异性扩增
• 考虑引物特异性 • 考虑模板是否降解
问题2：Ct值过大
解决方案： 1. 提高模板浓度，或重新制备模板（模板降解） 2. 优化扩增程序，或重新设计引物（引物扩增效率低） 3. PCR产物在100-300bp之间（扩增效率低） 4. 提高模板稀释倍数或重新制备模板（模板质量低）
直接呈现形式：Ct Value and ΔΔ Ct
qPCR的实验结果：可信度分析
——Ct value and ΔΔ Ct
☑ 扩增曲线无异常
n 扩增曲线线型标准 n CT值要求 1. 20-30个Cycle 2. 重复性：复孔差0.5循环以
内 n NTC和NRC无扩增
☑ 溶解曲线无异常
n 溶解曲线线型标准 n NTC和NRC无溶解曲线
实验分组：Jurkat cells were untreated or treated with PMA. Introdution: TNF in Jurkat cells is very low level.
• 难点1：低丰度基因Ct值的可信度
1. 扩增效率难以保证 2. 复孔间的重复性难以保证
• 难点2： ΔΔCT值的可信度
Main advantage: the starting DNA concentration
• in a closed-tube system
qPCR的检测基础：chemistry
DNA intercalating molecules
fluorophore-labeled oligonucleotides
➢ 在各组织和细胞中的表达相对恒定，不受研究因素、细胞周期等的影响。 ➢ 作用：校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 ➢ GAPDH、 Actin、 18S rRNA 等
ΔΔ Ct的可信度
——内参基因的选择
二、qPCR的实验安排
n 做好准备，万无一失（实验准备）
1/：模板制备与保存 2/：反转录实验 3/：qPCR实验
reproducible(Lowly-expressed gene)
• Expensive • primer-dimers might be formed
virus detection , viral/bacterial load quantitation, genotyping, allelic discrimination, mutation detection, SNP detection, gene expression analysis
☑ 标准曲线无异常
n 斜率 n 扩增效率：90-110% n R2 n NTC和NRC无值
Ct Value 的可信度：扩增曲线无异常
——软件的设置（基线设置和阈值设置）
阈值线
Ct 值
基线
阈值线和基线是仪器读出来的CT值准确的保证。
背景信号与Rox校正
基线设置
阈值设置
仪器默认：每一个Target都有一个阈值线。
Clin Chim Acta. 2015 Jan 15;439:231-50.
qPCR的检测基础：指数扩增
Determining Starting template concentration
qPCR的检测基础：指数扩增
qPCR VS PCR: qualitative or quantitative
qPCR的实验安排
——RNA模板的重要性
RIN值（RNA integrity number ）：
➢ RIN > 7为高质量，6-7勉强可用，< 6为较差质量 ➢ 该值可用Agilent 2100 Bioanalyzer仪器去检测
Sample Acquisition & Handling:
• Avoid cell contamination • Rapid sample handling • Avoid RNase contamination
阈值设置
原始扩增曲线
修正后的线性扩Leabharlann 曲线修正后的指数扩增曲线阈值设置
Ct 值
Ct Value 的可信度：溶解曲线无异常
——扩增产物分析
确认反应特异性，增加数据可信度
TM值
Tm值
Ct Value 的可信度：标准曲线无异常
——扩增效率分析
Determining Starting template concentration
3. qPCR扩增
Initial concentration of unknown
Log amount of standard
4. 标准曲线
y=-3.38x+32.9 R2 = 0.998 扩增效率%=（10-(1/斜率）-1）×100%=97.6%
ΔΔ Ct的可信度
——分析方法的可信度
gene expression analysis: ΔΔ Ct 前提：内参基因和目的基因的扩增效率接近，且接近100%。 内参基因：
• showing the presence or absence of the DNA sequence of interest • quantitative
AB
A＞B，且A=3B
A
B
A≈B
qPCR
PCR
qPCR的检测基础：指数扩增
Determining Starting template concentration
1. 内参基因的选择
第1种情况. 内参和目的基因扩增效率一致，且接近100%
第2种情况. 内参和目的基因扩增效率有差异
双标准曲线法
内参基因的选择
• First：通过绝对定量，测定扩增效率 • Second:提高模板质量，保证样本Ct值的可信度 • Third：如果模板足够，提高模板加入量，增加复孔间重复性 • Fourth:选择合适内参，校正移液误差
fluorescent reporter molecules
SYBR Green Ⅰ VS TaqMan Probe
Structure Advantages
Disadvantages Applications
DNA intercalating molecules
Intercalating dye • Lower costs • melting curve analysis
实时荧光定量PCR原理与分析方法 Real-time, fluorescence-based quantitative PCR
，
内容概要
1
荧光定量PCR概述
2
实验安排
3
常见问题
4
难点解答
qPCR能够解决什么问题
基础研究 分子诊断 动物疫病 食品安全
SNP鉴定 病毒检测 拷贝数检测 表达量检测 测序数据验证 微生物诊断
1B. 逆转录引物对cDNA产量的影响 2. 复杂结构的RNA的cDNA的合成
qPCR的实验安排
——qPCR Optimisation
Primer design
Amplification efficiency cDNA
concentration
NTC/NRC
in triplicate
90%–110%
理论上， Xn = X0×2n ; 实际上， Xn = X0×(1+E扩增效率)n ; 根据经验，固定Xn后， Log X0 = LogM-CTLog (1+E扩增效率)
R2 ≥ 0.98 扩增效率 90%-110%
扩增效率的判定——绝对定量
Ct
1. 标准品制备
2. 标准品稀释
R2 ≥ 0.98 扩增效率 90%-110%
RNA Extraction:
• Avoid RNase contamination
RNA Assessment:
• RNA purity: A260/280 ~2.0; A260/230 2.0~2.2 • RNA integrity: RIN • agarose gel
高质量RNA
基因组DNA残留
✔
✘
内容概要
1
荧光定量PCR概述
2
实验安排
3
常见问题
4
难点解答
qPCR的实验安排
n 知其然，知其所以然（实验结果）
1/：表达量差异的可信度
Seven Key Steps
n 做好准备，万无一失（实验准备）
1/：模板制备与保存 2/：反转录实验的安排 3/：qPCR实验的安排
一、实验结果
主要呈现形式：3大曲线
扩增效率：Primer design and testing
• Specificity, • Length, • GC content, • 3′ end stability, • sequence complexity, • melting temperature, • and location in the target sequence of the primers
• non-specific
pathogen detection, gene expression, mutation detection, SNP detection
fluorophore-labeled oligonucleotides (Taqman)
5´R---Q3´
• Specific • more sensitive and
• binds to the minor groove of dsDNA • non-specific • extension phase of each cycle of qPCR
• hydrolysis probe • specific PCR products • extension phase
蛋白残留
qPCR的实验安排
——反转录实验的重要性
Reverse Transcription Protocol：
20μl反转录体系 20μl定量体系
RNA样品 Total RNA: 100ng-1μg
gDNA去除后 的RNA
cDNA 5×-10×稀释
qPCR 1-2μl稀释液
1A. 逆转录酶对cDNA产量的影响
实验分组：Jurkat cells were untreated or treated with PMA. Introdution: TNF in Jurkat cells is very low level.
Calculation of TNF expression levels in Jurkat cells using the ΔΔCT method
问题3：重复性差
• 参考CT值可信度——仪器设置
• 考虑移液误差
1. 移液器失准 2. 模板浓度过低 3. 移液体积过小 4. 试剂、体系未彻底解冻、混匀
重复性较理想的扩增曲线 STD＜0.2
内容概要
1
荧光定量PCR概述
2
实验安排
3
常见问题
4
难点解答
Calculation of TNF expression levels in Jurkat cells using the ΔΔCT method
Primer3 Primer-BLAST mFold secondary structure of primers
determines
amplicon length, melting temperature and amplification efficiency
内容概要
1
荧光定量PCR概述
2
实验安排
3
常见问题
4
难点解答
问题1：非特异性扩增
• 考虑引物特异性 • 考虑模板是否降解
问题2：Ct值过大
解决方案： 1. 提高模板浓度，或重新制备模板（模板降解） 2. 优化扩增程序，或重新设计引物（引物扩增效率低） 3. PCR产物在100-300bp之间（扩增效率低） 4. 提高模板稀释倍数或重新制备模板（模板质量低）
直接呈现形式：Ct Value and ΔΔ Ct
qPCR的实验结果：可信度分析
——Ct value and ΔΔ Ct
☑ 扩增曲线无异常
n 扩增曲线线型标准 n CT值要求 1. 20-30个Cycle 2. 重复性：复孔差0.5循环以
内 n NTC和NRC无扩增
☑ 溶解曲线无异常
n 溶解曲线线型标准 n NTC和NRC无溶解曲线
实验分组：Jurkat cells were untreated or treated with PMA. Introdution: TNF in Jurkat cells is very low level.
• 难点1：低丰度基因Ct值的可信度
1. 扩增效率难以保证 2. 复孔间的重复性难以保证
• 难点2： ΔΔCT值的可信度
Main advantage: the starting DNA concentration
• in a closed-tube system
qPCR的检测基础：chemistry
DNA intercalating molecules
fluorophore-labeled oligonucleotides
➢ 在各组织和细胞中的表达相对恒定，不受研究因素、细胞周期等的影响。 ➢ 作用：校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 ➢ GAPDH、 Actin、 18S rRNA 等
ΔΔ Ct的可信度
——内参基因的选择
二、qPCR的实验安排
n 做好准备，万无一失（实验准备）
1/：模板制备与保存 2/：反转录实验 3/：qPCR实验
reproducible(Lowly-expressed gene)
• Expensive • primer-dimers might be formed
virus detection , viral/bacterial load quantitation, genotyping, allelic discrimination, mutation detection, SNP detection, gene expression analysis
☑ 标准曲线无异常
n 斜率 n 扩增效率：90-110% n R2 n NTC和NRC无值
Ct Value 的可信度：扩增曲线无异常
——软件的设置（基线设置和阈值设置）
阈值线
Ct 值
基线
阈值线和基线是仪器读出来的CT值准确的保证。
背景信号与Rox校正
基线设置
阈值设置
仪器默认：每一个Target都有一个阈值线。
Clin Chim Acta. 2015 Jan 15;439:231-50.
qPCR的检测基础：指数扩增
Determining Starting template concentration
qPCR的检测基础：指数扩增
qPCR VS PCR: qualitative or quantitative
qPCR的实验安排
——RNA模板的重要性
RIN值（RNA integrity number ）：
➢ RIN > 7为高质量，6-7勉强可用，< 6为较差质量 ➢ 该值可用Agilent 2100 Bioanalyzer仪器去检测
Sample Acquisition & Handling:
• Avoid cell contamination • Rapid sample handling • Avoid RNase contamination
阈值设置
原始扩增曲线
修正后的线性扩Leabharlann 曲线修正后的指数扩增曲线阈值设置
Ct 值
Ct Value 的可信度：溶解曲线无异常
——扩增产物分析
确认反应特异性，增加数据可信度
TM值
Tm值
Ct Value 的可信度：标准曲线无异常
——扩增效率分析
Determining Starting template concentration
3. qPCR扩增
Initial concentration of unknown
Log amount of standard
4. 标准曲线
y=-3.38x+32.9 R2 = 0.998 扩增效率%=（10-(1/斜率）-1）×100%=97.6%
ΔΔ Ct的可信度
——分析方法的可信度
gene expression analysis: ΔΔ Ct 前提：内参基因和目的基因的扩增效率接近，且接近100%。 内参基因：
• showing the presence or absence of the DNA sequence of interest • quantitative
AB
A＞B，且A=3B
A
B
A≈B
qPCR
PCR
qPCR的检测基础：指数扩增
Determining Starting template concentration
1. 内参基因的选择
第1种情况. 内参和目的基因扩增效率一致，且接近100%
第2种情况. 内参和目的基因扩增效率有差异
双标准曲线法
内参基因的选择
• First：通过绝对定量，测定扩增效率 • Second:提高模板质量，保证样本Ct值的可信度 • Third：如果模板足够，提高模板加入量，增加复孔间重复性 • Fourth:选择合适内参，校正移液误差
fluorescent reporter molecules
SYBR Green Ⅰ VS TaqMan Probe
Structure Advantages
Disadvantages Applications
DNA intercalating molecules
Intercalating dye • Lower costs • melting curve analysis
实时荧光定量PCR原理与分析方法 Real-time, fluorescence-based quantitative PCR
，
内容概要
1
荧光定量PCR概述
2
实验安排
3
常见问题
4
难点解答
qPCR能够解决什么问题
基础研究 分子诊断 动物疫病 食品安全
SNP鉴定 病毒检测 拷贝数检测 表达量检测 测序数据验证 微生物诊断
1B. 逆转录引物对cDNA产量的影响 2. 复杂结构的RNA的cDNA的合成
qPCR的实验安排
——qPCR Optimisation
Primer design
Amplification efficiency cDNA
concentration
NTC/NRC
in triplicate
90%–110%
理论上， Xn = X0×2n ; 实际上， Xn = X0×(1+E扩增效率)n ; 根据经验，固定Xn后， Log X0 = LogM-CTLog (1+E扩增效率)
R2 ≥ 0.98 扩增效率 90%-110%
扩增效率的判定——绝对定量
Ct
1. 标准品制备
2. 标准品稀释
R2 ≥ 0.98 扩增效率 90%-110%
RNA Extraction:
• Avoid RNase contamination
RNA Assessment:
• RNA purity: A260/280 ~2.0; A260/230 2.0~2.2 • RNA integrity: RIN • agarose gel
高质量RNA
基因组DNA残留
✔
✘
内容概要
1
荧光定量PCR概述
2
实验安排
3
常见问题
4
难点解答
qPCR的实验安排
n 知其然，知其所以然（实验结果）
1/：表达量差异的可信度
Seven Key Steps
n 做好准备，万无一失（实验准备）
1/：模板制备与保存 2/：反转录实验的安排 3/：qPCR实验的安排
一、实验结果
主要呈现形式：3大曲线