发酵工艺控制——代谢调控及育种

代谢调控及育种

从工业微生物育种史来看，诱变育种曾取得了巨大的成就，使微生物有效产物成百倍、乃致成千倍的增加。但是诱变育种工作量繁重，盲目性大。近年来由于应用生物化学和遗传学原理，深入研究了生物合成代谢途径以及代谢调节控制的基础理论，人们不仅可进行外因控制，通过培养条件来解除反馈调节而使生物合成的途径朝着人们所希望的方向进行，即实现代谢控制发酵；同时还可进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累有益产物的目的，即所谓代谢控制育种。内因是变化的根据，所以改变微生物的遗传型往往是控制代谢的更为有效的途径。代谢控制育种可以大大减少传统育种的盲目性，提高了效率。代谢控制育种很快在初级代谢产物的育种中得到广泛的应用，成就也十分显赫，几乎全部氨基酸和多种核苷酸生产菌株都被打上了抗性或缺陷型遗传标记。

代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。

一、克服反馈抑制和反馈阻遏的调控

克服反馈调节，可从以下两方面着手：降低末端产物浓度；应用抗反馈突变株

1、降低末端产物浓度

（1）营养缺陷型的利用

A、在直线式生物合成途径中

营养缺陷型突变株的代谢流受阻，末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈调节，可使代谢途径中的某一中间产物积累。一个典型的例子是谷氨酸棒状杆菌的精氨酸缺陷型突变株进行鸟氨酸发酵(，由于合成途径中酶6(氨基酸甲酰转移酶)的缺陷，必须供应精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生长，但是这种供应要维持在亚适量水平，使菌体达到最高生长，又不引起终产物对酶② (N—乙酰谷氨酸激酶)的反馈抑制，从而使鸟氨酸得以大量分泌累积。

B、利用营养缺陷型积累分支代谢途径中的中间产物

营养缺陷型突变导致协同反馈调节某一分支途径的代谢阻断，使这一分支途径的终产物不能合成。若控制供应适量的这一终产物，满足微生物生长，将使合成代谢流向另一分支途径，有利于另一终产物的大量积累。例如，谷氨酸棒杆菌生物素缺陷型是以葡萄糖或醋酸作为碳源，棒状杆菌经诱变处理后，基因发生突变，不能合成相应的酶，导致乙酰辅酶A和生物素之间的合成反应受到阻断，切断了支路代谢，代谢只能向着谷氨酸合成方向进行，因而产量得到累积。又如硫胺素缺陷型是在α-酮戊二酸与硫胺素之间的反应发生阻断，也使谷氨酸产量大幅度增加。又如次黄嘌呤核苷酸产生菌，是棒杆菌和短杆菌的腺嘌呤缺陷型菌株，其合成途径中酶③失活，控制限量补给腺核苷酸，可解除腺核苷对酶①的反馈调节，由于腺核苷酸和鸟核苷酸对酶①协同反馈调节，故代谢流偏向鸟苷酸这一分支途径

C、利用营养缺陷型积累分支代谢途径中的末端产物

工业上应用的重要例子是赖氨酸发酵。我国工业生产赖氨酸曾是一株高丝氨酸缺陷型菌株，由生产谷氨酸北京棒状杆菌ASl．299ASl 299经硫酸二乙酯处理后获得的。从图8．24可知，苏氨酸、高丝氨酸、

赖氨酸的前体是天冬氨酰半缩醛，诱变后，促使高丝氨酸脱氢酶的基因发生突变，导致合成高丝氨酸的代谢途径阻断，消除了苏氨酸和赖氨酸天冬氨酰激酶的协同反馈抑制，因而天冬酰半缩醛由原来负责合成3个氨基酸而代谢流完全导向赖氨酸方向进行，使赖氨酸产量大量累积。

（2）渗漏缺陷型的利用

渗漏缺陷型是一种不完全营养缺陷型，它不会产生过量的末端产物，因而可以避开反馈调节。但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成；在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，就能积累所需的产物。

（3）提高细胞渗透性

细胞内合成的发酵产物若要分泌到培养基中，必须经过细胞膜和细胞壁。如果产物不易分泌出细胞，而积累在细胞内，则会引起反馈调节。改变细胞膜和细胞壁的通透性，使其有利于

产物的分泌，也是降低末端产物浓度的一种途径。谷氨酸生产菌的细胞膜磷脂含量高时，细胞的通透性较差，磷脂含量低时，通透性较好。

A、营养缺陷型：生物素缺陷型突变株；油酸缺陷型突变株；甘油缺陷型突变株

B、温度敏感突变株的选育

C、溶菌酶敏感突变株

2、抗反馈突变株的利用

在以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径单一无分支，往往不能选用营养缺陷型突变株。要提高产量，最好采用抗反馈突变株。抗反馈突变株由于基因突变，它们的酶或无活性的原阻遏物不再与末端产物结合，从而不再发生酶的变构及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再与发生了突变的操纵基因结合，因此反馈调节被打破，即使在末端产物过量的情况下，也同样可以积累高浓度的末端产物。

抗反馈突变株通常可以用添加末端产物类似物的方法来筛选。末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成。在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了改变，它们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的情况下照常能合成该种末端产物。例如，用类似物D-精氨酸选出的谷氨酸棒杆菌的抗反馈突变株可使L-精氨酸的产量得到提高。

二、克服分解代谢阻遏的调控

生产中要克服分解代谢阻遏可采取下列措施：

1、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源

可采用相对来说不引起分解代谢阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有机酸和黄豆饼粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培养荧光假单胞菌，由于克服了半乳糖的分解代谢阻遏，结果在细胞中所产生的纤维素酶提高了1500倍。

2、流加碳源或氮源

在考虑经济效益而必须使用有阻遏作用的碳源或氮源时，缓慢流加碳、氮源可使分解代谢产物维持在较低的水平上，而不至于产生阻遏。

3、利用抗分解代谢阻遏的突变体

筛选方法：在以酶受阻遏的底物为唯一氮源的培养基上，选择能正常生长的菌落。

三、对诱导调节的控制

在生产上为了提高诱导酶的产量，对诱导调节控制的常用手段有：

1、添加诱导物类似物：在诱导物就是酶的底物的情况下，添加底物类似物来加强诱导作用是最好的。因为底物类似物不易被所形成的酶分解，而在细胞中始终保持较高的浓度，能够持续地诱导酶的合成，获得较高浓度的酶。

2、添加辅酶或辅助因子：在有些情况下，必须在培养基中添加辅酶才会产生诱导作用。例如：丙酮酸脱羧酶的合成需有硫胺存在。

3、利用组成型突变株：选育组成型突变株的方法，其主要原则是创造一种利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的选择优势以及适当的识别两类菌落的方法，从而把组成型突变株选择出来。