腺病毒的制备by王晶晶

腺病毒的制备

简介：

腺病毒(adenovirus)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，基因组长约36kb。基因组上分布着4个早期转录子（E1、E2、E3、E4）承担调节功能，以及一个晚期转录子负责结构蛋白的编码。其中，E1的缺失可造成病毒在复制阶段的流产，重组腺病毒必须在293细胞等表达E1蛋白的细胞系中包装；E3为复制非必须区，影响病毒的免疫逃逸，其缺失则可以大大地扩大插入容量。

腺病毒在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型。目前的腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础。腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100％的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，神经细胞和心脏细胞；容易制得高滴度病毒载体；进入细胞内并不整合到除卵细胞外的宿主细胞基因组中，仅瞬间表达，安全性高。腺病毒载体已成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。

基本概念：

RCA：

在扩增或制备复制缺陷型腺病毒时会产生复制型腺病毒（replication competent adenoviruses，RCA），RCA是因为重组腺病毒的基因组与293基因组的E1同源序列间发生重组而产生的。这就导致目的基因丢失而被E1区代替。具体表现是在本不支持病毒载体复制的细胞株（如A549细胞）上产生病毒的复制和扩增。实验证明，复制型腺病毒(RCA) 数量随着腺病毒载体在293细胞上的传代次数的增加而增加。RCA在其宿主细胞中可以自主复制和扩增，因此RCA的产生会严重干扰重组腺病毒载体的使用效果和带来安全隐患。要避免RCA出现，以下两点非常必要：

1）对原始毒种进行1~3轮空斑纯化；

2）尽量减少腺病毒在293细胞上的传代次数，建议建立至少两级病毒种子库。（尤为重要：一旦毒种中发现了RCA，建议重新重组出毒。）

各种常用病毒单位的含义：

VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的“活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。

IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。

VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽。

操作细节：

腺病毒的保存：

避免反复冻融，分装后液氮速冻，于-70℃保存，建议不要在-20℃下长期保存。腺病毒解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时（比如1011~12VP/ml），4℃可保存1~2周。

另外，保存病毒的缓冲液保持在pH8.0对维持滴度非常重要。

腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意的问题：

1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。

2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒，效果较好。

3）选择适当的转导MOI（病毒感染单位数/细胞数），可以在MOI为0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。

4）感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。如24孔板可用200ul，6孔板1ml。

5）感染时间为90-120分钟，即感染实验时，用尽量少的培养液覆盖细胞，接毒后2小时再补充足够的培养基。（可选：每15分钟轻轻晃动培养液一次，以混匀。）

6）选择适当表达检测时间，一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达，48小时表达达到较高水平。

下面按AdEasy TM腺病毒载体表达系统简述腺病毒的构建与制备流程：

1．将基因克隆入穿梭载体（shuttle）。（其中，pShuttle不含有启动子和polyA，pShuttle-CMV含有CMV启动子和polyA）

另外，还有pAdTrack-CMV载体，载体内有两套启动子和polyA，可根据GFP的表达跟踪目的基因的表达情况。

2．PmeI酶切构建好的shuttle质粒，电泳鉴定回收线性化的质粒。

3．线性化的质粒转化入BJ5183-AD-1感受态细胞（预先转化入了pAdEasy-1基因组DNA），Kan抗性的LB平板上篮白斑筛选。

4．挑选直径偏小的白色菌落，摇菌过夜，小量纯化大质粒（不能用普通试剂盒）。5．取1/5~1/2体积小量纯化后的质粒用PacI酶切检测，用重组前的shuttle质粒作酶切对照。0.8%的琼脂糖凝胶电泳。（如下图所示，4为重组前的shuttle质粒，5为pAdEasy-1基因组DNA，6为重组后的质粒。重组后的质粒经PacI酶切后，通常得到约30kb大片段和3.0kb或4.5kb的小片段）

6．将鉴定为重组阳性的质粒阳转入DH5α感受态。大量提取。

7．PacI酶切后，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀回收，脱盐，无菌去离子水溶解。

8．按照5ug线性化质粒/35mm dish的比例用jetPEI转染试剂转染293A细胞。9．培养7—14天，35mm dish中的转染后细胞出现CPE效应（细胞变圆飘起，细胞核区明显膨大）。收取原代病毒（107~8pfu/ml）：旧培养基重悬所有细胞，液氮/37o C反复冻融4-7次。12，000rpm收上清。分装后冻存于-80o C。

10．扩增病毒：向5×106个293A细胞（100mm培养皿，~60%汇度）中加入0.5ml 原代病毒保存液，加入培养基至1ml，混匀。37℃CO2培养箱中培养2小时。补加入9ml DMEM5%。再培养48~72小时，至半数左右细胞出现CPE。收集细胞，600×g 离心3~5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）缓冲液（病毒保存溶液）重悬细胞。液氮/37℃冻融4-7次，12，000rpm离心去除细胞碎片，收集上清。进行下一轮感染扩增。

11．培养3×108~109个细胞，接毒后48-72小时收裂解上清。在用氯化铯梯度离心纯化。12．氯化铯梯度离心法纯化病毒：

配好的CsCl/TE溶液（D=1.43）加至sw32Ti离心管中

沿着管壁从同一点往下填入病毒清液（不成滴，保证匀速成线）

Sw32Ti 25，600rpm（~112，700g）4o C 2hr

超净台中小心将分层后的上层（培养基/PBS）吸走

分层后的界面上有白色细条带（病毒带），取出（~2-3ml）

生理盐水中4o C透析过夜（500ml 0.9% NaCl/次X 3次）

加入2x冻存buffer

分装后液氮速冻，冻存于-80o C

备注：

sw32Ti离心管有38.5ml和10ml两种，用细管便于吸取；离心管洗净后115o C高压灭菌30分钟

溶液配制：

CsCl溶液密度D与溶液中CsCl的重量百分比浓度P之间的关系：

D=138.11/137.48-P

e.g.配制D=1.43的CsCl TE溶液，算出P=40.899，

按TE（1mM-10mM）密度=水密度

称40.9g CsCl 溶于59.1ml TE中，滤菌

2x冻存buffer（adapted from Nature protocol Vol.2 No.5,2007:1236-1247）: 10mM Tris pH8.0，100mM NaCl，0.1%BSA，20%glycerol