吸光光度法
吸光光度法
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计
光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计
分光光度法与分光光度计
722型分光光度计光学系统图
1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜 4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅 9.比色池；10.光电管
e 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液
的吸光度。单位： (L•mol-1 •cm-1)
桑德尔(Sandell)灵敏度： S 当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光
程内所能检测到的吸光物质的最低含量。 单位：mg/cm2
S=M/e
氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm
AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它 们此时分别全部以[HB]或[B-]形式存在。
pKa=pH+ lg
AB- - A A- AHB
lg AB- - A A- AHB
对pH作图即可求得pKa
2 络合物组成确定 饱和法（摩尔比法） 制备一系列含钌3.0×10-5 mol/L (固定不变)和不 同浓度（小于12.0×10-5 mol/L）的PDT溶液，按 实验条件，485nm测定吸光度,作图。
c 显色反应时间 针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定
d 显色反应温度 加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解
e 溶剂
有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率
吸光光度法
ε
S与
ε 关系式的推导： ε b c 可得 εbc
根据 S 的定义和 A = A = 0.001 =
因为 所以
A = 0.001 =
εbc
（1）
0.001 c= εb
将单位代入(1)式右端
0.001 mol ⋅ cm 0.001 mol c= ⋅ = ⋅ b cm εL εb L
即
0.001 mol c= ⋅ εb L
3、多元络合物(MRARB)的种类 a.三元混配络合物: 如V(v)—H2O2—PAR b.离子缔合物: [Ag(phen)2]+· [BPR]c.金属离子—络合剂—表面活性剂体系 如稀土元素—XO—CPB体系
d.杂多酸: 杂多酸 磷酸盐 + 钼酸盐 阴离子 或硅酸盐 （过量） 或砷酸盐 (如[PMo12O40]3-
6.2.3 测量波长和吸光度范围的选择 1、测量波长的选择 “最大吸收原则” 或“吸收最大， 干扰最小”原则。
2、吸光度范围的选择
一般控制标准溶液和被测试液的吸 光度在 0.2 ~ 0.8 范围内，才能保证 测量的相对误差较小。 原因 浓度测量的相对误差 Er 与透射 比 T（或吸光度）有关。
_________________
6.2.4 参比溶液的选择 1、参比溶液：光度测量时用来调节仪 器的零点的一种溶液。 2、参比溶液的用途 消除由于吸收池壁及溶剂对入射光 的反射和吸收带来的误差，并扣除 干扰的影响。如参比溶液选择不 当， 会使标准曲线不通过原点。
以 M + n R(过量，乙色) = MRn(甲色) 为例，说明参比溶液的重要性。 ——— A(甲)+A(乙) MRn + —— A(乙) R R (1)零点——————————— 水 —— A(甲) MRn + (2)零点______________ 调A(乙)=0 R R
吸光光度法
第20 章吸光光度法吸光光度法(light absorption method)是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。
包括比色法（colorimetric method）和分光光度法（spectrophotometry）。
前者是通过比较有色溶液颜色深浅来确定有色物质的含量；后者是根据物质对一定波长光的吸收程度来确定物质的含量的。
分光光度法包括紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometry）、可见光分光光度法（visible spectrophotometry）、红外分光光度法（infrared spectrophotometry）。
本章主要讨论可见光分光光度法。
20.1 概述20.1.1 物质对光的选择性吸收1. 光的性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。
光的偏振、干涉、衍射、折射等现象就是其波动性的反映，波长λ与频率ν之间的关系式：λν=c （c为光速）亦反映光的波动性。
光又是由大量具有能量的粒子流所组成，这些粒子称为光子。
光子的能量则反映微粒性，光子的能量E 与波长λ的关系：E = hν = hc/λ（h为普朗克常量）亦可用来表示光的微粒性。
由上述关系可知，光子的能量与光的波长（或频率）有关，波长越短，光能越大，反之亦然。
光的能量范围很广，在波长或频率上相差大约20个数量级。
不同光的波长范围及其在分析化学中的应用情况见表20-1。
表20-1 各种光的波长范围及其在分析化学中的应用情况光的名称波长范围跃迁类型分析方法X-射线远紫外光近紫外光可见光近红外光中红外光远红外光微波无线电波10-1~ 10nm10 ~ 200nm200 ~ 400nm400 ~ 750nm0.75 ~ 2.5μm2.5 ~ 50μm50 ~ 1000μm0.1 ~ 100cm1 ~ 1000mK和L层电子中层电子价电子价电子分子振动分子振动分子振动和低位振动分子转动X射线光谱法真空紫外光度法紫外光度法比色及可见光度法近红外光谱法中红外光谱法远红外光谱法微波光谱法核自旋共振光谱2. 物质的颜色与其对光的选择性吸收光可分为单色光与复合光，单色光（chromatic light）是仅具有单一波长的光，而复合光（polychromatic light）是由不同波长的光（不同能量的光子）所组成。
第九章 吸光光度法
发生相互作用。 假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。 当溶液浓度c >10 －2 mol/L 时，吸光质点间可能发 生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的 形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化 ，影响吸光度。
度的乘积成正比。 朗伯——比耳定律不仅适用于有色溶液，也适 用于其它均匀、非散射的吸光物质(包括液体、气 体和固体)，是各类吸光光度法的定量依据。
A bc
式中，A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol· －１； L
无线电波 11000m
光谱名称 波长范围 X射线 0.1—10nm 远紫外光 10—200nm
跃迁类型
辐射源
分ห้องสมุดไป่ตู้方法 X射线光谱法
真空紫外光 度法
K和L层电子 X射线管 中层电子 氢灯 氢灯 钨灯
碳化硅热棒
近紫外光 200—400nm 价电子 可见光 400—750nm 价电子
近红外光 0.75—2.5μ m 分子振动 中红外光 2.5— 分子振动 5.0μ m
A总 lg(I01 I02 ) /(I01 10
1bc
I02 10
2bc
)
讨论: A总 lg(I0 I0 ) /(I0 10
1 2 1
1bc
I02 10
2bc
)
(1) 1= 2 = 则： A总 ＝lg（Ｉo/Ｉt）＝ bc
(2) 若 2≠ 1 ；A与C则不成直线关系。 2与 1
I0 A lg I t A Kbc
吸光光度法
显示装置
6.2
光度分析法的设计
1 显色反应（color reaction）
待测物质本身有较深的颜色，直接测 定；待测物质是无色或很浅的颜色，需 要选适当的试剂与被测离子反应生成有 色化合物再进行测定，此反应称为显色 反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent）。
6.2
光度分析法的设计
苯 (254nm) A 甲苯 (262nm)
230
250
270
苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱
6.1 概述
在可见光，KMnO4溶液 对波长525 nm附近绿色光 的吸收最强，而对紫色和 红色的吸收很弱。λmax= 525 nm。浓度不同时， 光吸收曲线形状相同， λmax不变，吸光度不同。
光吸收程度最大处的波 长，称为最大吸收波长， 常用λ最大或λmax表示， 任何可见光区内、溶液 的颜色主要是由这个数值决定的。
6.1 概述
溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm
吸收光
颜色
400-450 450-480
480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
紫 蓝
绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
黄绿 黄
橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
6.1 概述
其实，任何一种溶液．对不同波长的光的吸收
程度是不相等的。如果将某种波长的单色光依 次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各 种单色光的吸收程度，以波长为纵坐标，以吸 光度为纵坐标可以得到一条曲线，叫做吸收光 谱曲线或光吸收曲线。它清楚地描述了溶液对 不同波长的光的吸收情况。
项目五——吸光光度法
03
吸光光度法的仪器和试剂
分光光度计
01
定义
分光光度计是分光光度法中使用的核心仪器，用于测量溶液对特定波长
的光的吸光度。
02 03
工作原理
分光光度计通过光源发出连续光谱的光，经过单色器分光后，得到特定 波长的单色光，照射到样品上，然后通过检测器检测透过样品的光强， 从而计算出样品的吸光度。
类型
常见的分光光度计有紫外-可见分光光度计、红外分光光度计等。
酶活性测定
某些酶催化的反应会产生或消耗具有 特定吸光特性的物质，利用吸光光度 法可以测定这些物质的浓度变化，从 而推算出酶的活性。
工业生产中的吸光光度法
产品质量控制
在某些工业生产过程中，产品的吸光特性与其质量密切相关。通过吸光光度法测 量产品的吸光度，可以实时监控产品质量，确保生产过程的稳定性和产品的一致 性。
通过合成具有更高选择性和灵敏度的试剂和探针，提高吸光光度法 对目标分析物的检测灵敏度。
引入多元校正技术
利用多元校正算法，消除干扰因素，提高吸光光度法在复杂样品中 的测量精度和灵敏度。
拓展应用领域和范围
环境监测领域
将吸光光度法应用于大气、水体 等环境样品的检测，实现对环境
污染物的快速、准确测定。
生物医学领域
引入人工智能、物联网等技术， 实现吸光光度法仪器的远程操控 、数据自动处理和分析等功能， 提高仪器的易用性和分析效率。
多功能集成
将多种分析方法集成到一台仪器 中，实现一台仪器同时具备多种 分析功能，提高仪器的综合性能
和应用范围。
谢谢您的聆听
THANKS
常见试剂
常见的吸光光度法试剂有显色剂、还原剂、氧化剂等。
使用注意事项
吸光光度法
(1)棱镜的色散
棱镜有玻璃和石英两种材料．它们的色散原理是依 据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不 同波长的光分开． 由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于 350 ~ 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域 内．石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 ~ 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三 个光 域．
目视比色法特点： 目视比色法的主要缺点是准确度不高，如 果待测液中存在第二种有色物质，甚至会 无法进行测定。 由于许多有色溶液颜色不稳定，标准系列 不能久存，经常需在测定时配制，比较麻 烦。 但设备简单，操作简便，比色管内液层厚 使观察颜色的灵敏度较高，且不要求有色 溶液严格服从比耳定律，因而它广泛应用 于准确度要求不高的常规分析中。
（2）光栅的色散
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用 于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有 良好的、几乎均匀一致的分辨能力．它具有色散波
1. 光色的互补关系
单色光； 复合光； 人眼能感觉到的光称为可见光（其波长范围大约 在400~750nm之间）。 日光、白炽灯光等可见光都是复合光。
如果把两种适当颜色的单色光按一定强度比例混 合后，就能得到白光。我们便称这两种单色光为 互补色光。
2. 物质对光的选择吸收
7.5目视比色与分光光度计
定义：用眼睛观察，比较待测 物质溶液颜色深浅以测定其含 量的方法 标准系列 应用： 准确度要求不高的中间 控制 限界分析：要求确定样品 中待测组分含量是否在规定的 最高含量限界以下 特点： 未知样品 1. 优点：仪器简单、操作方 便、适于大批样品的分析 2.缺点： 主观性大、准确度差
当一束白光（强度为I0 ）通过下列几种溶液，溶 液呈现的颜色和吸收光的关系如下图：
第章吸光光度法
本章主要讲授可见吸光光度法。
10.1概述
10.1.1 吸光光度法的特点
1．光的基本性质
光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用
波长、频率、光速c、波数（cm-1）等参数来描述： = c ； 波数 = 1/ = /c
ε：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１；
或:
A＝lg（I0/It)= a b c
c：溶液的浓度，单位g·L－１
a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１
a与ε的关系为：
a =ε/M （M为摩尔质量）
吸光度与光程的关系 A = bc
吸光度
0.00
光源
检测器
吸光度
0.22
b
光源
检测器
吸光度
0.44
(2) ≠0 若 <0 ；即 2< 1 ； － bc>0,
lg(1＋10 bc )值随c值增大而增大，则标准曲线偏离
直线向c 轴弯曲，即负偏离；反之，则向A 轴弯曲，即正偏
离。
讨论:
A总 =A1 + lg2 - lg(1＋10－εbc )
(3) ｜ ｜很小时，即ε1≈ε2：
可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生偏离。若
令： ε1-ε2 ＝ ； 设： Ｉo1 ＝Ｉo2
A总 ＝ lg(2Io1)/Ｉt1(1＋10 - εbc ）
＝ A 1 + lg2 - lg(1＋10 - εbc ) 讨论:
讨论:
A总 =A1 + lg2 - lg(1＋10－εbc )
(1) = 0； 即： 1= 2 =
第七章 吸光光度法
三、吸光度范围的选择 研究表明，当T=0.368，即A=0.434，测量 的相对误差为最小。当T=15%-65%时，即 A=0.2-0.8时测量的相对误差≤±2%，能满 足分析测定的要求，故吸光度在0.2-0.8为 测量的适宜范围。
2、化学因素： ①、Beer定律要求在稀溶液的情况下才适用，当待测液浓度过
高（M>10-2mol.l-1）时，则会引起误差。
②溶液的吸光物质常因解离、综合或互变影响或产生副反应而 改变其浓度，导致偏离。 3、其它因素：如待测试样是胶体溶液，新溶液或有悬浮物质时， 使得吸光物质不均匀，当λ射光透过溶液时，除了部分被吸收
第七章 吸光光度法
内容提要 概述（理解） 吸光光度法的基本原理（掌握） 显色反应及显色条件的选择（了解） 测量条件的选择（掌握） 目视比色与分光光度计（了解） 吸光光度法的应用（掌握）
§7-1 概 述
前面所学滴定分析和质量分析都属于化学分析法，适用于含
量高于1%常量组分的测定，测定结果的相对误差可控制
物质吸光能力大小的量度，它表示浓度为1mol.l-1的溶液，在1cm的比
色皿中，在一定温度和一定波长下的吸光度。
在吸光光度法中，有时也用透射比T来表示物质吸收 I 光的能力： T
I0
因此引出A与T之间存在以下关系： A lg I 0
I
lg
1 T
lg T
即：
A lg
1 T
KbC
综合考虑液层厚度与浓度对光吸收的影响，即得到朗伯-比尔的 数学表达式：
A lg
I0 I
KbC
它的物理意义是：当一束单色光平行照射到均匀，非散射性的吸光物质的
溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度C和液层厚度b的乘积成正比。
吸光光度法 PPT
T It I0
朗伯(Lambert J H)与比尔(Beer A)分别于 1760与1852年研究了光的吸收与溶液层的厚 度及溶液浓度的定量关系,二者结合称为朗伯比尔定律,也称为光的吸收定律。
光栅(grating)是依照光的衍射与干涉原理将复 合光色散为不同波长的单色光,然后再让所需波 长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率 比棱镜大,可用的波长范围也较宽。
3、吸收系统——比色皿或吸收池
用于盛放试液的容器。它是由无色透明、耐腐 蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的,按 其厚度分为0、5cm,lcm,2cm,3cm与5cm。
• 偏离朗伯－比尔定律的原
因主要是仪器或溶液的实际
条件与朗伯—比尔定律所要
求的理想条件不一致。
1、物理因素
(1)非单色光引起的偏离
* 朗伯-比尔定律只适用于单色光,但由于单色器
色散能力的限制与出口狭缝需要保持一定的宽度, 因此目前各种分光光度计得到的入射光实际上都 是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长 光的吸收程度的不同,因而导致对朗伯－比尔定ຫໍສະໝຸດ * 分子吸收光谱 -带状光谱
molecular absorption spectrum →由电子能级跃迁而产生吸收光谱[能量差
在1~20(eV)],为紫外及可见分光光度法。
UV/Vis Spectrophotometry →由分子振动能级(能量差约0、05~l eV)与
转动能级(能量差小于0、05 eV)的跃迁而 产生的吸收光谱,为红外吸收光谱。用于 分子结构的研究。
B 络合:显色剂与金属离子生成的是多级络合物,且各 级络合物对光的吸收性质不同,例如在Fe(Ⅲ) 与 SCN-的络合物中,Fe(SCN)3颜色最深,Fe(SCN)2+颜 色最浅,故SCN-浓度越大,溶液颜色越深,即吸光度 越大。
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是一种广泛应用于化学分析和生物科学研究中的定量分析方法。
它通过测量样品溶液对特定波长的光的吸收程度来定量分析物质的浓度。
吸光光度法基于光的著名的“比尔-朗伯定律”，该定律描述了物质溶液对光的吸收与其浓度之间的关系。
通过测量光的吸收度，我们可以推算出浓度。
吸光光度法的基本原理是根据物质溶液对特定波长的光的吸收程度与溶液中物质的浓度之间的线性关系。
具体来说，当光通过物质溶液时，物质分子或离子会吸收光的能量，使光强度降低。
根据比尔-朗伯定律，光的吸光度（A）与物质的浓度（c）之间存在如下关系：A=εlc，其中ε是吸光度的摩尔吸光系数，l是光程长。
通过测量光的吸光度和已知的吸光度摩尔吸光系数，我们可以计算出溶液中物质的浓度。
在实践中，吸光光度法通常使用分光光度计来进行测量。
分光光度计可以发射一束特定波长的光，并测量光通过样品溶液前后的光强度差异。
这种差异可以转化为吸光度，并用于计算物质的浓度。
吸光光度法有许多应用领域。
在化学分析中，吸光光度法可以用于分析金属离子、化学物质的浓度、酸碱度等。
它可以通过配备合适的试剂和仪器来满足不同的分析需求。
在生物科学研究中，吸光光度法被广泛应用于测量DNA、蛋白质和酶的浓度。
通过测量DNA和蛋白质在特定波长下的吸光度，可以确定它们的浓度，进而研究其相互作用、结构和功能。
吸光光度法还可以用于测量酶的活性，通过测量酶和底物之间的反应，可以确定酶的催化能力。
吸光光度法有许多优点。
首先，它是一种快速、简单和经济的分析方法。
与其他方法相比，吸光光度法仪器简单、成本低，且操作方便。
其次，吸光光度法具有较高的选择性和灵敏度。
通过选择合适的波长和试剂，可以实现对特定物质的高度选择性测量。
此外，吸光光度法对微量物质的测量也非常敏感，可以达到微克或纳克级别的浓度测量。
然而，吸光光度法也存在一些限制。
首先，该方法对于有色的物质比较适用。
对于无色物质，需要经历一系列的试剂反应使其形成有色产物，才能进行吸光度测量。
第11章 吸光光度法
k——比列系数
分析化学
其中，浓度c的单位有两种表示方法： 1、以质量浓度（g· -1）为单位，相应k称 L
为吸收系数用“a”表示，则：A=abc
2、以物质的量浓度（mol· -1）为单位，相 L
应k称为摩尔吸收系数，用“κ”表示，则：
A=κbc
较常用，下面 的讨论均为此 种关系
分析化学
分析化学
不同的物质，对光的吸收性能不同，其κmax 也不同。显然，κmax越大的物质，在相同浓度下 的吸光度越大，其测定的灵敏度也越高。即： κmax∝灵敏度。 通常情况下，为获得较好的测量效果，一般 要求：κmax＞104 L· -1· -1 mol cm
吸光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数κmax表示外， 还常用桑德尔灵敏度表示。其定义见P280，常用符号S表示， S与κmax的关系为：
S=M/κ
M——被测物的摩尔质量
分析化学
二、吸光度A—浓度c的关系曲线：
按朗伯—比尔定律，当物 质一定，波长一定，吸收层 厚度一定时，A—c应呈线性 关系（如右图）： 但实践中，若处理不好， 关系曲线常有偏离——分正偏 差、负偏差两种情况： 正偏差（A测＞A理）； 负偏差（A测＜A理）。
分析化学
A A A
t0
t
t0
t
t1
t2
t
稳定型：产物一 旦产生，便非常 稳定（最理想的 类型，可在t0以 后测定）
不稳定型：产 物形成后逐渐 分解（不能用 于吸光分析）
半稳定型：产物较 稳定，经一段时间 放臵后才逐渐分解 （应抓紧时间在t1 至t2测定）
分析化学
④温度： 不同的显色反应需不同的温度，有的常温下即可 进行，有的需加热，有的在高温下要分解，故应根 据不同情况选择适宜温度。
第七章 吸光光度法
• 注:
摩尔吸光系数− ε 摩尔吸光系数−反映灵敏度的指标
•
molar absorptivity
显色条件的确定(实验确定 二.显色条件的确定 实验确定 显色条件的确定 实验确定)
• (一)绘制吸收光谱A-λ曲线 绘制吸收光谱A • 确定λ 作为入射光波长. 确定λmax作为入射光波长. • (二)显色剂用量 达到吸光度A值最大且稳定的a,b a,b间任 达到吸光度A值最大且稳定的a,b间任 选一点. 曲线确定最佳用量. 选一点.做A-VR曲线确定最佳用量. (三)酸度 pH太高,M水解 太高,M水解; pH太高,M水解; pH太低,R发生酸效应 太低,R发生酸效应. pH太低,R发生酸效应. pH曲线确定最佳酸度范围 曲线确定最佳酸度范围. 做A-pH曲线确定最佳酸度范围.
∴选择显色的最佳条件依据: 选择显色的最佳条件依据
• 在提高灵敏度和选择性前提条件下， 在提高灵敏度和选择性前提条件下， 吸光度达最大且平稳所对应的pH、 VR, 吸光度达最大且平稳所对应的 、 温度t( 、 时间t(min)和溶剂的种类 温度 ℃)、 时间 和溶剂的种类 和溶剂量. 和溶剂量.
§7-5 吸光度测量条件的选择
作用:调仪器吸光度为零. 作用:调仪器吸光度为零.(或T=100%) T=100% 100 可抵消非显色物对光的吸收, 可抵消非显色物对光的吸收 , 突出显色 化合物MR对光的吸收. MR对光的吸收 化合物MR对光的吸收. 溶剂空白—溶剂或去离子水作空白 溶剂或去离子水作空白. 溶剂空白 溶剂或去离子水作空白. 试剂空白—除被测不加外 其余试剂均加. 除被测不加外, 试剂空白 除被测不加外,其余试剂均加.
标准曲线绘制如下: 标准曲线绘制如下
0
第十一章_吸光光度法[1]
![第十一章_吸光光度法[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/3d0d2d2d0812a21614791711cc7931b765ce7b2d.png)
第⼗⼀章_吸光光度法[1]第⼗⼀章吸光光度法第⼀节吸光光度法概述吸光光度法是光学分析法的⼀种，也称为吸收光谱法。
它是基于物质对光的选择性吸收⽽建⽴起来的分析⽅法。
吸光光度法包括⽐⾊法、可见光分光光度法、紫外分光光度法、红外光谱法和原⼦吸收分光光度法。
吸光光度法根据分⼦的特征吸收光谱可以进⾏定性分析, 根据分⼦的吸光程度⼤⼩可以进⾏定量分析。
吸光光度法的特点如下：（１）灵敏者度⾼可⽤于测定微量组分的含量，测定下限可达10-5~10-6mol·L-1。
若被测组分在测定前先进⾏分离和富集，实验的灵敏度还可以提⾼。
（２）准确度较⾼⽐⾊法的相对误差为5%~20%，分光光度法的相对误差为2%~5%。
吸光光度法的准确度虽然不如滴定分析法⾼，但对微量组分的测定，已完全能满⾜要求。
（３）简便快速吸光光度法所使⽤的仪器设备简单，价格便宜，⼀般实验室都能具备。
仪器的操作简单，易于掌握。
（４）应⽤范围⼴⼏乎所有的⽆机离⼦和有机化合物都可直接或间接的⽤分光光度法进⾏测定。
⽬前分光光度法在实验室中是⼀种常规的分析⽅法。
本章主要介绍其中的⽬视⽐⾊法和可见光分光光度法。
第⼆节基本原理⼀、光的本质与溶液的颜⾊光是⼀种电磁波，通常⽤频率或在真空中的波长来描述。
不同波长（或频率）的光，能量不同。
波长短的光能量⼤，波长较长的光能量⼩。
如按波长⼤⼩顺序排列即得表11－1所⽰的电磁波谱。
表11－1 电磁波谱区域波长范围跃迁类型光谱类型ｘ射线10-3~10（nm）内层电⼦跃迁ｘ射线吸收、发射、衍射，荧光光谱、光电⼦能谱远紫外10~200（nm）价电⼦和⾮键电⼦跃迁远紫外吸收光谱，光电⼦能谱紫外200~400（nm）紫外-可见吸收和发射光谱可见光400~750（nm）近红外0.75~2.5（µm）分⼦振动近红外吸收光谱红外 2.5~1000（µm）分⼦振动红外吸收光谱微波0.1~100（cm）分⼦转动、电⼦⾃旋微波光谱，电⼦顺磁共振⼈的⾁眼可按颜⾊分辨在可见光区域内不同波长的光，在可见光区各种有⾊光与波长范围如表11-2所⽰。
吸光光度法
第十章 吸光光度法
第1讲
第十章 吸光光度法
吸光光度法（ 吸光光度法 （ Absorption Photometry） 是一 ） 种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种 分析方法。包括可见吸光光度法、紫外-可见吸光 分析方法 。 包括可见吸光光度法 、 紫外 可见吸光 光度法和红外光谱法等。 光度法和红外光谱法等。 吸光光度法同滴定分析 重量分析法相比，有以下一些特点： 法、重量分析法相比，有以下一些特点： (一)灵敏度高 吸光光度法测定物质的浓度下 一 灵敏度高 最低浓度)一般可达 的微量组分。 限 (最低浓度 一般可达 最低浓度 一般可达1-10-3%的微量组分 。 对固 的微量组分 体试样一般可测到10 体试样一般可测到 -4%。如果对被测组分事先加 。 以富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级 个数量级。 以富集，灵敏度还可以提高 个数量级。
第30讲 30讲第十章 吸光度法第1讲在分光光度测定中， 在分光光度测定中，盛溶液的比色皿都是采用相 同质且的光学玻璃制成的， 同质且的光学玻璃制成的，反射光的强度基本上是不 变的(一般约为入射光强度的 一般约为入射光强度的4％ 其影响可以互相抵消 其影响可以互相抵消， 变的 一般约为入射光强度的 ％)其影响可以互相抵消， 于是可以简化为 I0＝It+Ia 纯水对于可见光的吸收极微， 纯水对于可见光的吸收极微，故有色液对光的吸 收完全是由溶液中的有色质点造成的。 收完全是由溶液中的有色质点造成的。 当入射光的强度I 一定时，如果I 越大， 就越小， 当入射光的强度 0一定时， 如果 a越大 ， It就越小 ， 即透过光的强度越小， 即透过光的强度越小，表明有色溶液对光的吸收程度 就越大。 就越大。 实践证明，有色溶液对光的吸收程度， 实践证明，有色溶液对光的吸收程度，与该溶液 的浓度、液层的厚度以及入射光的强度等因素有关。 的浓度、液层的厚度以及入射光的强度等因素有关。 如果保持入射光的强度不变， 如果保持入射光的强度不变，则光吸收程度与溶液的 浓度和液层的厚度有关。 浓度和液层的厚度有关。
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是化学分析中常用的一种分析方法，用于测定物质溶液中某种物质的浓度。
其原理是利用物质对特定波长的光吸收的特性，通过测量光的透射或反射来推算出物质的浓度。
吸光光度法的基本原理是比尔定律，即物质溶液对光的吸收与其浓度成正比。
根据比尔定律，当光通过物质溶液时，其强度将减弱，而减弱的程度与物质的浓度成正比。
比尔定律的数学表达式为：A=εlc，其中A表示吸光度，ε表示摩尔吸光系数，l表示光程长度，c表示溶液浓度。
在使用吸光光度法进行分析之前，首先需要选择适当的波长。
每种物质对光的吸收有其特定的波长范围，称为吸收峰。
选择适当的波长可以提高分析的准确性和灵敏度。
吸光光度法的实验步骤通常包括以下几个步骤：1. 准备样品：根据需要测定的物质选择相应的样品，并将其溶解在适当的溶剂中，以得到一个浓度在可测范围内的溶液。
2. 校准仪器：使用一系列已知浓度的标准溶液，通过测量它们的吸光度与浓度之间的关系，建立起一条标准曲线。
这条曲线可以用来根据样品的吸光度推算出其对应的浓度。
3. 测量样品：将校准好的仪器置于样品测量位，并使样品溶液通过光路。
根据仪器的操作方法，控制光源的强度，选择波长，并记录下通过样品溶液的光的吸收强度。
4. 计算浓度：根据标准曲线上对应的吸光度值，利用比尔定律的数学关系，计算出样品的浓度。
需要注意的是，在进行吸光光度法测量时，还需要注意以下几个因素：1. 光程长度：光程长度会直接影响到吸光度的数值。
因此，在进行测量时，要保持光程长度一致，以避免测量结果的误差。
2. 溶剂选择：溶剂选择要适合样品的性质，并且要尽量选择透明度高的溶剂，以减少光的吸收。
同时，还要注意溶剂对标准溶液的影响，以保证测量结果的准确性。
3. 波长选择：选择合适的波长可以提高分析的准确性和灵敏度。
通常情况下，选择物质的吸收峰为测量波长是一个比较好的选择。
4. 仪器校准：在进行样品测量之前，需要对仪器进行校准。
校准的目的是建立起样品吸光度与浓度之间的关系，以便后续计算浓度。
《吸光光度法教案》课件
《吸光光度法教案》PPT课件第一章：引言1.1 吸光光度法的定义1.2 吸光光度法在分析化学中的应用1.3 吸光光度法的原理1.4 吸光光度法的仪器与操作步骤第二章：吸光光度法的原理2.1 光的吸收与发射2.2 朗伯-比尔定律2.3 摩尔吸光系数2.4 吸光度的计算与单位第三章：分光光度计的结构与操作3.1 分光光度计的组成部分3.2 分光光度计的操作步骤3.3 光谱仪的使用与维护3.4 波长的选择与调整第四章：标准曲线的制备与分析4.1 标准曲线的制备方法4.2 标准曲线的绘制与分析4.3 样品浓度的计算与误差分析4.4 实际案例分析：药物含量测定第五章：吸光光度法的应用5.1 环境监测中的应用5.2 生物化学中的应用5.3 食品分析中的应用5.4 临床诊断中的应用第六章：吸光光度法的准确度与精确度6.1 准确度的评估6.2 精确度的评估6.3 干扰因素及其影响6.4 提高吸光光度法准确度的方法第七章：溶液的制备与处理7.1 溶液的配制方法7.2 溶液的浓度与体积的计算7.3 样品的前处理与分离7.4 样品分析中的常见问题与解决方法第八章：光散射与吸光光度法8.1 光散射现象的介绍8.2 光散射对吸光光度法的影响8.3 光散射的测定与分析8.4 光散射在吸光光度法中的应用案例第九章：吸光光度法在药物分析中的应用9.1 药物分析中的重要性9.2 药物的紫外吸收特性9.3 药物含量测定的方法与步骤9.4 实际案例分析：药物制剂中主成分的测定第十章：现代吸光光度法技术进展10.1 光纤吸光光度法10.2 微透析吸光光度法10.3 激光吸光光度法10.4 在线监测与自动化分析技术第十一章：吸光光度法在有机合成中的应用11.1 有机化合物的紫外吸收特性11.2 有机合成中光催化反应的监控11.3 有机物含量的测定与分析11.4 实际案例分析：有机合成产物的纯度测定第十二章：吸光光度法在材料科学中的应用12.1 材料科学中的光吸收现象12.2 吸光光度法在材料合成与表征中的应用12.3 材料性能与吸光性质的关系研究12.4 实际案例分析：纳米材料粒径的测定第十三章：吸光光度法在生命科学中的应用13.1 生物大分子的紫外吸收特性13.2 蛋白质浓度与纯度的测定13.3 核酸的定量分析与监测13.4 实际案例分析：细胞培养中的营养物质监测第十四章：吸光光度法在环境监测中的应用14.1 环境污染物的紫外吸收特性14.2 水质分析与监测14.3 大气污染物分析与监测14.4 实际案例分析：水体中有机物的总量测定第十五章：实验与练习15.1 吸光光度法的基本实验操作15.2 标准曲线与样品分析的实验操作15.3 常见干扰因素的实验探究15.4 综合实验练习：饮料中维生素C含量的测定重点和难点解析重点：1. 吸光光度法的定义、原理及其在分析化学中的应用。
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第九章 吸光光度法1.与化学分析法相比，吸光光度法的主要特点是什么？答：①灵敏度高 ②仪器设备简单，操作简便，快速 ③ 准确度较高 ④ 应用广泛 2.何谓复合光、单色光、可见光和互补色光？白光与复合光有何区别？ 答：⑴复合光指由不同单色光组成的光；单色光指其处于某一波长的光；可见光指人的眼睛所能感觉到的波长范围为400-750 nm 的电磁波；将两种适当颜色的光按照一定的强度比例混合若可形成白光，它们称为互补色光； ⑵ 白光是是一种特殊的复合光，它是将各种不同颜色的光按一定的强度比例混合而成有复合光。
3.简述朗伯-比尔定律成立的前提条件及物理意义，写出其数学表达式。
答：确定前提为：①入射光为平行单色光且垂直照射；② 吸光物质为均匀非散射体系；③吸光质点之间无相互作用；④辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象发生。
其物理意义如下：当一束单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度A 与吸光物质的浓度c 及吸收层厚度 b 成正比。
其数学表达式为： Kbc TI I A t===1lglg0 4.摩尔吸收系数κ在光度分析中有什么意义？如何求出κ值？κ值受什么因素的影响？ 答：⑴摩尔吸光系数κ在光度分析中的意义：当吸光物质的浓度为1mol/L 和吸收层厚度为 1cm 时，吸光物质对某波长光的吸光度。
(2)在吸光物质的浓度适宜低时，测其吸光度A ，然后根据bcA=κ计算而求得。
(3) κ值受入射光的波长，吸光物质的性质、溶剂、温度、溶液的组成、仪器灵敏度等因素的影响。
5.何谓吸光度和透射比，两者的关系如何？答：吸光度A 是指入射光强度I 0与透射光强度I t 的比值的对数值。
透射比T 是指透射光强度I t 与入射光强度I 0的比值。
两者的关系如下：TI I A t 1lg lg0== 6.在光度法测定中引起偏离朗伯-比尔定律的主要因素有那些？如何消除这些因素的影响？答：⑴物理因素：①非单色光引起的偏离 ②非平行入射光引起的偏离 ③ 介质不均匀引起的偏离。
⑵化学因素：①溶液浓度过高引起的偏离 ② 化学反应引起的偏离。
消除这些影响的方法：采用性能较好的单色器 采用平行光束进行入射，改造吸光物质使之为均匀非散射体系，在稀溶液进行，控制解离度不变，加入过量的显色剂并保持溶液中游离显色剂的浓度恒定。
7.分光光度计的主要部件有哪些？各部件的作用是什么？答：分光光度计的主要部件有：光源、单色器、吸收池、检测系统、信号显示系统。
光源能提供具有足够发射强度、稳定且波长连续变化的复合光。
单色器的作用是从光源发出的复合光中分出所需要的单色光。
吸收池是用于盛装参比溶液、试样溶液的器皿。
检测系统是利用光电效应把通过吸收池后的透射光变成与照射光强度成正比的光电流，再进行测量。
信号显示系统的作用是检测光电流强度的大小，并以一定的方式显示或记录下来。
8.吸收光谱曲线和标准曲线的实际意义是什么？如何绘制这种曲线？答：吸收光谱曲线是吸光光度法选择测量波长的依椐，它表示物质对不同波长光吸收能力的分布情况。
由于每种物质组成的特性不同决定了一种物质只吸收一定波长的光，所以每种物质的吸收光谱曲线都有一个最大吸收峰，最大吸收峰对应的波长称为最大吸收波长，在最大吸收波长处测量吸光度的灵敏度最高。
在光度分析中，都以最大吸收波长的光进行测量。
吸收光谱曲线的绘法：在选定的测定条件下，配制适当浓度的有色溶液和参比溶液，分别注入吸收池中，让不同波长的单色光依次照射此吸光物质，并测量此物质在每一波长处对光吸收程度的大小（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得。
标准曲线是微量分析常用的一种定量分析方法。
在一定的测定条件和浓度范围内，吸光度与溶液之间有线性关系，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，一般可得一条通过坐标原点的直线，即工作曲线。
利用工作曲线进行样品分析时，非常方便。
标准曲线的绘法：首先在一定条件下配置一系列具有不同浓度吸光物质的标准溶液（称标准系列），然后在确定的波长和光程等条件下，分别测量系列溶液的吸光度，绘制吸光度-浓度曲线，即为标准曲线。
9.吸光光度法测定对显色反应有何要求？从哪些方面来考虑显色反应的条件？答：要求：选择性要好、灵敏度要高、对比度要大、有色化合物要稳定、组成要恒定，显色反应的条件要易于控制。
考虑显色反应的条件为：显色剂的用量；溶液的酸度；时间和温度；有机溶剂和表面活性剂；共存离子的干扰及消除。
10.溶液的酸度对显色反应的影响表现在哪些方面？如何选择和确定最适宜的酸度？答：溶液的酸度对显色反应的影响表现在以下几个方面：对被测物质存在状态的影响；对显色剂浓度和颜色的影响；对络合物组成和颜色的影响。
选择和确定最适宜酸度的方法是：固定被测组分.显色剂和其它试剂的浓度，配成一系列酸度不同的显色溶液，测量其吸光度，绘制吸光度—酸度曲线，曲线中吸光度最大且恒定的酸度区间即为显色反应适宜的酸度范围。
11.为了提高测量结果的准确程度，应该从哪些方面选择或控制光度测量的条件？答：1、选择合适的入射波长。
一般为最大吸收波长，如果有干扰时，可选择用灵敏度较低，但能避开干扰的入射波长。
2、控制准确的读数范围。
一般控制在0.15-0.80，为此，可通过控制试样的称量、稀释或浓缩试样、改变吸收池的厚度。
3、、选择适当的参比溶液。
12.为什么示差光度可以提高测定高含量组分的准确度？答：应用差示光度法测定高含量组分时，由于利用稍低于试样溶液的标准溶液作参比，所测试样溶液的吸光度则是标准参比溶液和试样溶液浓度之差的吸光度，即两溶液吸光度之差与两溶液浓度之差成正比：ΔA=κΔC=κ(C x-C s)由于C比ΔC大得多，故测定C的误差就比ΔC的误差小得多。
示差光度可以提高测定高含量组分的准确度的原因，是因为用稍低于试样溶液浓度的标准溶液作参比，调节T%为100%时，相当于把光度计读数标尺进行了扩展。
13.简述用摩尔比法测定络合物络合比的原理。
答：在一定的条件下，假设金属离子M 与络合剂R 发生下列显色反应（略去离子电荷）：M+nR=MR n为了测定络和比n ，可固定金属离子的浓度C M ，改变络和剂的浓度C R ，配置一系列C R /C M 不同的显色溶液。
在络和物的x ma .λ处 ，采用相同的比色皿测量各溶液的吸光度，并对C R /C M 作图。
在显色反应尚未进行完全阶段，此时C R /C M <n ，故吸光度A 随C R 的增加而上升。
在显色反应进行完全时，溶液的吸光度基本保持不变，曲线的转折点E 所对应的C R /C M =n 。
实际上在转折点附近，由于络和物多少有离解，故实测的吸光度要低一些。
14.双光束分光光度计与单光束分光光度计相比有什么不同？有哪些特点？答：它们的不同点有：双光束分光光度计比单光束分光光度计结构复杂，可实现吸收光谱的自动扫描，价格昂贵，用途广泛，光路设计要求严格。
双光束分光光度计具有较高的测量精密度和准确度，而且测量方便快捷，特别适合进行结构分析。
15.有50.00 mL 含Cd 2+5.0 μg 的溶液，用10.0 mL 二苯硫腙-氯仿溶液萃取（萃取率≈100%）后，在波长为518 nm 处，用1㎝比色皿测量得T=44.5%。
求吸收系数a 、摩尔吸收系数κ和桑德尔灵敏度s 各为多少？ 解：依题意可知被萃取后Cd 2+ 的浓度为：L g /100.51010100.5436---⨯=⨯⨯ A=-lgT=-lg0.445=0.351124100.7100.5135.0---⋅⋅⨯=⨯⨯==cm g L bc A a κ=11444100.810869.741.112100.5135.0---⋅⋅⨯≈⨯=⨯⨯cm m ol L 4100.841.112/⨯==κCd M S =1.4×10-3 µg·cm -2 16.钴和镍与某显色剂的络合物有如下数据：λ/nm 510 656 κCo /L×mol -1×cm -1 3.64×104 1.24×103κNi /L×mol -1×cm -1 5.52×1031.75×104将0.376g 土壤试样溶解后配成50.00 mL 溶液，取25.00ml 溶液进行处理，以除去干扰物质，然后加入显色剂，将体积调至50.00 mL.此溶液在510 nm 处吸光度为0.467，在656 nm 处吸光度为0.374，吸收池厚度为1 cm 。
计算钴镍在土壤中的含量（以μg ·g -1表示）。
解：根据题意列出方程组 A 1=κ 1 x bC x +κ1Y bC y A 2=κ2X bC x +κ2Y bC y 已知：A 1=0.476 A 2=0.374 κ1x =3.64×104 κ2X =1.24×103κ1Y =5.52×103 κ2Y =1.75×104 解得 C x =0.96×10-5 mol ·L -1 C y =2.07×10-5 mol ·L -1 M x =[C x ×0.05×2×58.9332]/0.376=152μg ·g-1 M y =[C y ×0.05×2×58.6934]/0.376=323μg ·g-117．某钢样含镍为0.12﹪，用丁二肟显色，κ=1.3×104 L ·mol -1·cm -1.若钢样溶解显色以后，其溶液体积为100.0 mL ，在λ=470 nm 处用1cm 的吸收池测量，希望测量误差最小，应称取试样多少克？解。
要使测量误差最小，则T=e -1=0.368 lnT=-1 c=kb434.0- ×lnT=3.34×10-5 mol/L 应采取的质量m=0012.06934.581.01034.35⨯⨯⨯-=0.16g答：应采取的质量试样为0.16g18．用硅钼蓝分光广度法测定硅的含量。
用下列数据绘制标准曲线： 硅标准溶液的浓度/mg ·mL -1 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 吸光度（A ）0.210 0.421 0.630 0.839 1.01测定试样时称取钢样0.500 g ，溶解后转入50 mL 容量瓶中，与标准曲线相同的条件下测得吸光度A=0.522，。
求试样中硅的质量分数。
解：根据题意得Ac(mg/ml)由图得ab=4.200 硅的质量百分数 %100%⨯=MmSi %24.1%100500.01050200.4522.0%1003=⨯⨯⨯=⨯⨯=-sm V b A κ 答：试样中硅的质量百分数为1.24%。