第5章 发酵菌种的制备

36株为诱导型
1.4 工业微生物菌种的分离
实例：醛肟水解酶的筛选
培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2~3 d移去一半培养物，补充新鲜培养基 不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离菌落 --Journal of biotechnology 94(2002), 65-72
1.4 工业微生物菌种的分离
1.4 工业微生物菌种的分离
一、菌种分离的一般过程 样品采集
→
预处理 → 增殖培养 → 纯培养
→ 菌种的鉴定 → 生产性能测定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物
复合酶系
问题：如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现 复合菌系
1.4 工业微生物菌种的分离
二、采样时要注意的问题
五、目的微生物富集方法的研究进展
目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%，微生物的
多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。
陈文新（科学院院士） ， 2002
分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物
的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等
FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73～81
1.5 发酵高产菌种的选育
目的
防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量
开发新产品
1.5 发酵高产菌种的选育
方法
基因突变： 自然选育、诱变育种 基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化： 点突变、易位PCR、同序法
二、诱变育种
（一）、诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染 色体畸变和基因突变两大类。
（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择
压硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
二、诱变育种 （三）、诱变育种的一般步骤 （P103） 诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。
已工业化产品生产菌的介绍
三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、气候等
1.4 工业微生物菌种的分离
三、目的微生物富集的一些基本方法
富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。 富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件，进行培养。 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆 菌和地衣牙孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
1.2 发酵工业对菌种的要求
1) 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且 产量高； 2）培养条件易于控制；
3）生长速度快，发酵周期短；
4）满足代谢控制的要求； 5）抗噬菌体和杂菌的能力强；
6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化；
7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、 降低成本有重要意义；
从形态的角度
菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。
1.4 工业微生物菌种的分离
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌 采样（造纸厂） →80℃ 30 min处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4 d，选择有凹陷圈的菌落 26株为组成型 从285个土样中获得62株
不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这
时只能通过随机分离的办法
1.4 工业微生物菌种的分离
三、目的微生物富集的一些基本方法
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等，
但主要是通过培养的方法
http://211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm
三、目的微生物富集的一些基本方法
黄色短杆菌F9-50的诱变谱系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) F6-16 (leu -, Thr -)
1.6 菌种的退化与保藏
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点
一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种、 合适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制，其
中菌种是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良
性能而考虑和设计的。 能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它 们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能 力强、易变异改造等特点。
已工业化产品生产菌的介绍
二、氨基酸生产有关的微生物
20世纪50-60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发 酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点： 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地
称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
In contrast to this traditional approach, modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of `nonculturable' organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.
第八章 发酵动力学
第十二章 展望
第五章 发酵菌种的制备
1 发酵wenku.baidu.com业微生物菌种的选育
2 工业微生物种子的扩大培养
3 种子培养基及其制备
http://211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm
第五章 发酵菌种的制备
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点 1.2 发酵工业对菌种的要求 1.3 工业生产常用的微生物菌种 1.4 工业微生物菌种的分离 1.5 发酵高产菌种的选育
发酵工程
南阳师范学院 生命科学与技术学院
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第一章
第二章 第三章
发酵工程总论
发酵设备 发酵工业原料及其处理
发 酵 工 程
第四章
第五章 第六章 第七章 第九章 第十章 第十一章
发酵工业灭菌
发酵菌种的制备 发酵工业放大 微生物发酵机制 发酵过程工艺控制 发酵染菌及防治 发酵工业废物、废水处理和资源化技术
8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳 源利用；
9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生 物活性物质和毒素，以保证安全。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
地球上的微生物资源非常丰富，
目前已发现的仅占其总数的1%~5%，
而在工业生产中被利用的仅有数百种，
制备菌悬液
诱变处理
营养缺陷型突变菌株的筛选 抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株 的筛选 组成型突变株的筛选 抗性突变株的筛选
突变菌株的筛选
随 机 筛 选
形 态
理 化 性 质
黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制
AK:天冬氨酸激酶
HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
结构类似物抗性：Lys的类似物AEC, Thr的类似物AHV 营养缺陷型：如Thr缺陷型
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板划线法 平板稀释法 平板分离 挑选单菌落 发酵试验 选择性培养法 随机分离法 注意形态的观察
1.5 发酵高产菌种的选育
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选， 称为诱变育种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 （P103） 物理：紫外，快中子，射线，激光 诱变剂 化学：硫酸二乙酯（DES），亚硝基胍（NTG） 生物：噬菌体，转座子
二、氨基酸生产有关的微生物
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶
HT:高丝氨酸转乙酰酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸 的合成调节机制
1.3 工业生产常用的微生物菌种
二、氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚，简单 谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌 其他氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
分属于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、
担子菌、藻类。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
真菌（青霉素、头孢等） 放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
1.3 工业生产常用的微生物菌种
1.5 发酵高产菌种的选育
自然选育在工业生产上的意义
问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
1.5 发酵高产菌种的选育
自然选育操作步骤：
(二) 真核细胞表达系统
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
DNA Shuffling等
1.5 发酵高产菌种的选育
一、自然选育
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9。 自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。
定向培养的富集方法
1、底物 3、培养时间 2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度 的手段，培养（固体、液体；分批、连 续）后使目的微生物在种群中占优势。
1.4 工业微生物菌种的分离
四、菌落的选出
从产物角度出发
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。 例：
礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱 变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。 筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能 力。
诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到 达到高产菌株。
二、诱变育种
（三）、诱变育种的一般步骤
出发菌株的选择
自然界直接分离到的野生型菌株
经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株