多糖的分离纯化

BSP 精制
BSP 经 DEAE 纤维素 DE52 分离后，可得 3 个峰 (图 1)，透析 (截留分子 量 8 000 ～ 14 000)、浓 缩、冻干各峰组分，得到 BSP-1、BSP-2、BSP-3。
取10 g BSP，200 mL 纯化水充分溶解后过DEDA 纤维素 DE-52 离子交换柱 (60 mm × 950 mm)， 依次用0～1.0mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，分管收集洗脱液，采用 “2. 2” 项下方法，以洗脱管 数为横坐标，多糖浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。
感谢在座各位聆听
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采用高效凝 胶过滤色谱 (HPGFC)测 定BSP各组 分的分子量
仪器与材料
Hale Waihona Puke Baidu仪器
Agilent 1200 HPLC 色谱仪 AE240 分析天平 UV-2102PC 紫外可见分光光 度计 FD-1C-55 冻干机 旋转蒸发仪 超滤仪 DZG-6020 减压干燥箱
材料
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莼菜嫩叶；无水乙醇； NaOH；盐酸；木瓜蛋白酶； 聚酰胺树脂； DEAE 纤维 素 DE-52；琼脂糖凝胶 Sepharose CL-6B； 透析 袋；蒽酮、硫酸；纯化水
粗多糖纯化
酶解灭活脱蛋白
粗多糖用 2.5 L 纯化水复 溶，加入木瓜蛋白酶，63 ℃ 酶解 6 h，灭活过滤除去不溶 物，滤液进行第2 次酶解灭活 脱蛋白。
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滤膜过滤浓缩
再用微孔滤膜过滤，滤液用超滤 膜超滤浓缩至800mL 后加入无水乙醇 至67%，4 ℃ 静置过夜后离心，80% 乙醇洗涤 3 次，减压干燥。
(7. 8 mm × 300 mm) 串联; 保护柱 TSKPWxl Guard column; Agilent 1260 示差折光检测器; 流动相为纯化水; 体积流量0. 4 mL/min; 进样量 30μL; 柱 温30 ℃ ; 检测器温度 35 ℃ ; 环境温度 25 ℃ 。
称取葡聚糖对照品、莼菜多糖各组分样品（BSP1、BSP2、BSP3），分别用纯水溶解并配 制成2mg/mL的溶液，过 0. 22 μm微孔滤膜，取续滤液，将图谱数据导入 GPC软件，建立分子 量分布标准曲线，得到分子量对数 log MW与洗脱体积 VR的线性回归方程 log MW = 10. 513 － 0. 2377VＲ(r = 0. 996 2)，
微量元素， • 多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于叶底部、
茎周围的黏液质中，是莼菜发挥药效的主要物质基础。
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方法流程
采用碱提醇沉 工艺，经除蛋 白、除色素得 到莼菜多糖 (BSP)
再经DEAE纤维 素DE-52柱 Se p h a r o s e CL-6B琼脂糖 凝胶柱对BSP 进行分级精制
粗多糖的提取
除去脂溶性成分
取250g莼菜喷干粉，加无水乙 醇2.5 L，60 ℃ 旋转回流提取2 h， 过滤，重复操作 1 次，除去脂溶性成 分，滤渣烘干。
莼菜喷干粉
新鲜莼菜嫩叶，经 清水淋洗、均浆机剪切、 喷雾干燥得莼菜喷干粉 。
莼菜粗多糖
加40倍 0. 3 mol/L NaOH 溶液，70 ℃ 加热搅拌提取 2 h，加盐酸中和，过滤， 滤液浓缩，加入无水乙醇至 67% ，4 ℃静置 过夜，4 500 r/min 离心 20 min，80% 乙醇 洗涤 3 次，沉淀减压干燥，得 83 g 莼菜粗 精多品课糖件。
莼菜多糖的分离纯化
汇报人：丁楚蔚
PPT制作：丁楚蔚、汪心妍 背景资料：谭晓菁、江淑华
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目录
研究背景 实验步骤与结果 总结与展望
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1 研究背景
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莼菜
• 睡莲科，多年生水生草本植物，又名马蹄草， • 有调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、
降血脂等功效 ， • 含酸性多糖、多酚、蛋白质、氨基酸、维生素、组胺及
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聚酰胺层析
滤液流经预处理的聚酰胺 层析柱脱色，滤液与聚酰胺湿 填料的体积之比为1∶1，纯化 水洗脱，共收集洗脱液 8 L。
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得到BSP
获得灰白色胶状莼菜多 糖 (BSP) 22 g，收率为 8. 8% 。
BSP含有量测定
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葡萄糖标准曲线制作
利用蒽酮硫酸法： 以葡萄糖质量浓度为横坐 标 (X)，吸光度为纵坐标 (A)得曲线方程 A = 17. 294X －0. 0076 (Ｒ2 = 0. 9994)。
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BSP纯度测定
精密称取干燥至恒重的 BSP 24.72 mg 至 500mL 量瓶，纯化水溶解并定容， 摇匀，测定样品吸光度为 0.521，计算可知 BSP的 纯度为 61. 89% 。
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紫外检测
粗多糖经木瓜蛋白酶脱蛋 白、聚酰胺脱色素等处理 后，紫外全波长扫描显示 在 260、280 nm 处其吸光 度接近于零，表明已除去 蛋白质、核酸等杂质。
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将莼菜多糖各组分导入 GPC 软 件，调用标准曲线，得出莼菜多糖 各组分的Mw、Mn 和 D 等，
结果见表 1，莼菜多糖的分子量 分布为 (1. 0507 ～ 1. 5208) × 106 Da，分子量较大。
图 3 显示，高效凝胶渗透色 谱图出峰时间单一，可知莼菜多糖 各组分均一性良好。
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BSP 精制
洗脱曲线 (图 2) 表明， 莼菜精制多糖 BSP-1、 BSP-3 组分均一，分别 浓缩、冻干 。
对 2 个主要组分 BSP-1、BSP-3 用琼脂糖凝胶柱 Sepharose CL-6B 进一步的分离纯化，用纯化 水洗脱，蒽酮-硫酸显色法测定多糖含有量。
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分子量测定 色谱条件: 色谱柱 TSK gel G5000PWxl ( 10 )、 G4000PWxl ( 10 )、G3000PWxl (7)