乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂盒产品说明书

乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂是一种旨在通过乙酰胆碱酯酶反应系统中，在抑制剂存在与否的情况下，所释放出巯基胆碱，与Ellman试剂反应后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来评价样品酶活抑制能力的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种抑制剂筛选检测。

产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又称为红细胞胆碱酯酶（RBC cholinesterase），广泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在脑组织、神经肌肉连接处（neuromuscular junction）、中枢神经系统的胆碱能突触（cholinergic synapses）和红细胞膜上高度表达，催化主要的神经传导介质乙酰胆碱的水解反应，产生乙酸和胆碱，终止突触传导。

其功能在于调节乙酰胆碱作用。

神经毒气，例如有机磷沙林（Sarin），抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经肌肉瘫痪，最终发生窒息（asphyxiation）。

血清乙酰胆碱酯酶浓度显著降低与有机磷杀虫剂中毒有关，因此血液检测是环境污染的重要指标。

基于人工合成底物碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide），在抑制剂存在与否的情况下，通过乙酰胆碱酯酶的作用，水解产生乙酸和硫代胆碱（thiocholine），与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析乙酰胆碱酯酶抑制剂的效应。

乙酰胆碱酯酶反应系统为：
Acetylcholinesterase
acetylthiocholine iodide →acetate + thiocholine
inhibitor
DTNB + thiocholine →TNB + choline-S-S-TNB
产品内容
缓冲液（Reagent A）20毫升
反应液（Reagent B）2毫升
底物液（Reagent C）2毫升
阴性液（Reagent D）1毫升
产品说明书1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照；有效保证6月
用户自备
乙酰胆碱酯酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、测定准备
1．准备好待测样品，置于冰槽里备用
2．开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零
3．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照
4．缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度
二、抑制剂筛选
1．在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
2．按下表加入试剂，进行样品预处理
3．分别移取130微升缓冲液（Reagent A）到新的96孔板的所有孔里
4．分别加入25微升反应液（Reagent B）
5．分别加入25微升底物液（Reagent C）
6．轻轻摇动96孔板
7．在37℃温度下孵育3分钟
8．加入20微升上述预处理的待测样品
9．即刻放进37℃酶标仪检测：测读15分钟
10．（选择步骤）完全酶活计算：
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.20（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫
克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔硫代胆碱/分钟
11．抑制活性计算：
1)[（完全活性读数－空背景对照读数）－（抑制剂样品活性读数－样本背景读数）]÷（完全活性
读数－空背景对照读数）＝实际抑制百分率
2)IC50：50％抑制率所需的抑制剂浓度
X（所需抑制剂样品浓度）＝（已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率）X 50％3）直接构建抑制曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为已知抑制剂浓度
注意事项
1．本产品为20次操作
2．操作时，须戴手套
3．样品须澄清，至关重要
4．加样后3秒内比色测定
5．测定值由低到高变化；测定可持续15分钟
6．用户根据实际需求，可以调整纯酶的浓度
7．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
8．可以使用乙酰胆碱酯酶抑制剂（1,5-bis(4-allyldimethylammoniumphenyl)pentan-3-one dibromide；
BW284c51；IC50=30纳摩尔）作为抑制剂对照
9．乙酰胆碱酯酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够生成1微摩尔硫代胆碱所需的酶量作为一个活性单位
10．本公司提供系列乙酰胆碱酯酶检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感。