生化物质的分离纯化技术
第08章生化分离高级纯化技术
杂质分子则直接流出。变换通过层析柱的溶液组成，促使配基
与亲合物（目的物）解离，即可获得纯化目的产物。
目标产物
杂蛋白
亲和层析操作示意图
三、亲和层析介质
A、亲和配基：
酶抑制剂：
生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，
抑制酶的活性。
抗体：
利用抗体为配基的亲和层析又称免疫亲和层析 （Immunoaffinity chromatography），抗原与抗体之间 具有高度特异性结合能力。
（1）求出标准蛋白质分子量与洗脱体积的关系
标准蛋白质 蓝色葡聚糖 牛血清蛋白 胃蛋白酶 Cytc 分子量 20000 67000 36000 13000 lgM 5.301 4.826 4.556 4.114 Ve 20 37 44 50
（2）绘制标准蛋白质分子量与洗脱体积标准曲线图
Ve
lgM
（3）根据未知蛋白质洗脱体积求出相对分子量
6、料液流向： 轴向流层析 径向流层析
三、适用于大规模生物分子纯化的层析方法
分离方法 凝胶过滤 分离原理 分子大小 特 点 应 用 分辨率为中等，但对脱盐效果 优良；流速较低，容量受样本 体积的限制 大规模纯化的最后步骤，任 一阶段可脱盐，尤其适用于 两种缓冲液交替
离子交换
电
荷
分辨率高，流速快，容量很高， 最适用于大量样品处理的前 体积不受限制 阶段
凝胶体积（Vm）：凝胶颗粒基质本身所占的体积； 在限定的层析条件下，Vt和V0都恒定值，而Ve随水分离
物分子质量的变化而变化。
讨论：
（1） Kav ＝0时，则Ve＝ V0 ，洗脱体积等于孔隙体积，完 全 排阻（组分Ⅰ） ； （2） Kav＝1时，则Ve＝ V0 ＋Vi ，洗脱体积等于孔隙体积 和内水体积之和，小分子完全进入凝胶内部（组分Ⅲ）； （3）0＜ Kav ＜1，内水体积只有一部分被组分利用，扩散 渗透 （组分Ⅱ）。
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
生化分离技术及应用课件PDF版
物质在凝胶层析柱被排阻的范围均在均在0～100％ 之间，被排阻的程度由可用分配系数Kav表示： Kav:分离化合物在内水和外水体积中的比例关系 Kav＝Ve－V0／Vt－V0 分离物分子质量大，Kav值小，反之，则增大 Kav 既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白 质分子量的重要依据。
(1)Ve = Vo Kd = 0 分子完全被排 阻于凝胶颗粒 之外 全部分布于流 动相里,最先流 出。
案对蛋白质进行分离
一 离心机
㈠种类
离心机
(分析性超速离 心主要用于检测 大分子物质的沉 降特征和结构等)
制备型
分析型 分析性超速离心机
普通离心机
冰冻离心机
台式（或地 面式）普通 离心机
台式高、超速 离心机 0.6-10万转/分
大容量冰 冻 离心机 0.6-2.5万
⒊等密度梯度离心
原理：不同颗粒存在浮力密 度差时，在离心力场下， 在密度梯度介质中，颗粒 或向下沉降，或向上浮起 ，一直移动到与它们各自 的密度恰好相等的位置上 形成区带，从而使不同浮 力密度的物质得到分离。
介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样 品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度 中进行再分配。 此法常用CsCl、等做介质,一般应用于物质的大小相近，而 密度差异较大时。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
(2)Ve = Vo + Vi Kd = 1 分子完全不被 排阻 完全向凝胶颗 粒内部扩散，最 后流出. Kd=0
(3) 0 <Kd <1 Ve = Vo +ViKd •为物质以某种程 度向凝胶颗粒内扩 散
0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
凝胶过滤法测定相对分子量
生化分离原理与技术
生化分离原理与技术
生化分离原理与技术是用于分离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）或小分子的一种方法。
下面将介绍几种常见的生化分离原理与技术。
1. 凝胶电泳：凝胶电泳是一种将生物大分子按照大小和电荷分开的方法。
常见的凝胶电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在凝胶中施加电场后，生物分子会在凝胶中进行迁移，并形成不同的带状图案，进而实现分离。
2. 超速离心：超速离心是利用离心力的巨大差异来分离生物大分子的技术。
通过离心机的高速旋转，离心力会将不同大小和密度的生物分子分层沉淀，从而实现分离。
3. 液相色谱：液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）
是一种基于生物分子在固定相和流动相中的相互作用力差异进行分离的方法。
常见的液相色谱包括反相液相色谱、离子交换液相色谱等。
生物分子会在固定相表面与流动相相互作用，从而实现分离。
4. 亲和层析：亲和层析是利用配体和目标生物分子之间的高特异性结合来实现分离和纯化的方法。
将具有亲和性的配体固定在固定相上，目标生物分子在流动相中与配体结合，而其他非特异性结合的分子则被洗脱出来，以实现分离和纯化。
5. 薄层层析：薄层层析是一种将混合物中的生物分子通过涂覆在薄层质地的固定相上进行分离的方法。
在薄层质地上施加溶
剂后，生物分子会因为在固定相上的不同亲和力而移动，从而实现分离。
这些生化分离原理与技术在生物科学研究和生物制药工业中起着重要的作用，能够帮助研究人员分离和纯化生物大分子，进而深入了解其结构和功能。
分离纯化的前期步骤
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（二）有机溶剂提取法
❖ 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链 较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀 酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶 剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂 性、是理想的提脂蛋白的提取液。
内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来； ❖ 另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。 ❖ 硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，
需用硫酸或氨水调节。
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影响因素
❖ 温度: ❖ 除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，
一般可在室温中进行。 ❖ 一般温度低蛋白质溶介度降低。 ❖ 但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋
❖ 此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对 其他蛋白质则易使之变性，甚至切断肽链。
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（6）细胞自溶法
❖ 利用细胞自身的酶
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(7)丙酮法（冷丙酮脱水抽提）
❖ 丙酮等脂溶性溶剂可溶解细胞膜上的脂质化合 物，从而使细胞膜的结构破坏。
❖ 一般是将细胞制成丙酮干粉后，再加提取酶。
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(8)酶处理方法
❖ 当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当 方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开 来。
❖ 一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机 溶剂分级分离等方法。
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❖ 第三步是细分级(fine fractionation)，也就是样 品的进一步提纯。
❖ 样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大 部分已被除去。
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生化分离工程
错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤 吸 附 喷 干
憎 水 结晶
电泳
基本定义
生化分离工程的定义：
为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相 关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培 养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提 取、分离纯化、富集生物产品的过程 (Downstream Processing)。
1）、在设计前，首先要掌握的产物物化性质，主要包括：
(1)、溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等； (2)、分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义； (3)、沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义； (4)、极性大小； (5)、分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等； (6)、功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据； (7)、免疫原性。设计亲和色谱； (8)、稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素
6)、提供产品竞争力的关键技术之一。WTO，降低生产成本、 提高产品标准。
7)、环境污染的治理（慢性铅中毒）
作业：检阅文献，谈谈分离科学的作用
刊原：
1)、纯分离分析期刊：Bioassay(IF = 6.227); Anal. Chem.(IF = 4.650); Separ. Purif Method(IF = 3.600); Electrophoresis(IF = 3.465); Adv. Chromatogr (IF = 3.067); J Chromatogr A(IF = 2.768); LC GC-Mag Sep Sci(IF = 2.393); J Chromatogr B(IF = 1.867)。调研论文数/月、本学科国际发展的速度
1）、凝胶 2）、亲和色谱 3）、离子交换
生化分离技术
一、名词解释（3分×5＝15分）⒈生化分离技术:从含有目标产物的发酵液、酶反应液或动植物细胞培养液中，提取精制并加工制成高纯度的、符合规定要求的各种产品技术，又称为下游加工技术⒉包涵体：蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。
⒊结晶：固体物质以晶体状态从气相或液相中析出的过程，是相态变化过程，通过结晶最终实现相态的平衡⒋凝胶色谱：又称体积排阻色谱、分子筛色谱。
是利用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱。
⒌絮凝作用：利用带有许多活性官能团的高分子线状化合物吸附多少个微粒的能力，通过架桥作用讲许多微粒聚集在一起，形成粗大松散絮团的过程。
⒍蒸发：溶液中的溶剂会啊进入气相中的过程。
其实质是溶液中的溶剂由液态变成气态，进而与溶液中溶质实现分离过程。
⒎浓差极化:在膜分离过程中，由于水和小分子溶质透过膜，大分子溶质被截留在膜表面出聚积，使得膜表面上被截留大分子溶质浓度增大，高于主体中大分子溶质浓度，这种现象称为浓差极化⒏晶习：指在一定环境中，晶体的外部形态。
⒐分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰底宽度的比值。
⒑干燥：通过气化而使湿物料中水分除去的方法。
四、问答题（30分）⒈青霉素发酵液预处理的目的是什么？生产中采用哪些方法？（10分）答：①除去无极离子或蛋白质②鼓式真空过滤机⒉简述薄层层析板的制备方法及薄层层析操作方法。
（10分）答：①制备：调浆、涂布、取洁静的干燥载玻片均匀涂层干燥、将载玻片水平放置，室温子下自然晾干活化70烘干30min。
切断电源，带载玻片面温度下降至不烫手时取出。
②在大小适当的玻璃板上，均匀涂上吸附剂，厚度在一毫米以内，然后在距底边1。
5厘米处点上样品溶液，形成一个小点，称为“原点”。
再将薄层板置于盛有动相溶剂的玻缸内（此溶剂称为“展开溶剂”，玻缸称为“展开槽”）。
当溶剂沿薄层扩散到距原点以上一定距离时（一般10—12厘米），取出薄层板，记录展开溶剂扩展前沿距原点的距离A。
蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件讲解学习
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
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当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
玻璃匀浆机
b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相 互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可 达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于 动物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法
生化分离技术 细胞破碎分离
细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离
原料液 原料液
细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 路线一 路线二 清液－胞外产物
路线一A
粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 )
通过改变微生物生长环境（温度、pH、缓 冲液），可以诱发产生自溶酶或激发产生其 它的自溶酶，以达到自溶目的。
缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后 细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
（2）物理法
渗透压冲击法 冻结-融化法 干燥法
①渗透压冲击法
将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定 浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作 用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩， 当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞
之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，
释放出内含物。
WSK卧式高效全能珠磨机
②影响珠磨法破碎的因素
破碎作用公式：
ln[1/(1-R)]=Kt
R — 破碎率；K— 一级反应速度常数； t—时间。 K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环 速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及 温度等相关。
②影响珠磨法破碎的因素
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质 和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次 生壁一般较厚 (4μm以上 ) ，常有三层组成。
n
在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初 生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更 紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。
二
生化物质的分离纯化技术
4．原料来源
血管舒缓素可分别从猪胰脏 和猪颚下腺中提取，两者生物学 功能并无二致，而稳定性以颚下 腺来源为好，因其不含蛋白水解 酶。
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5．原料解剖学部位
猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而 胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则 可提高各产品的收率。
胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白 酶 (pepsin) 则 以 采 取 胃 底 部 粘 膜 为 好 ， 因胃底部粘膜富含消化酶。
6
2．在生物材料中，有些化合物 含量很低或极微，有的只有1／l0 000， 甚至更少。制备时，原材料用量很 大，得到产品很少，与投料量相比 “虎头蛇尾”。近年来，用所谓 “钓鱼法”，利用某些分子特有的 专一亲和力，将某一化合物从极复 杂的体系中“钓”出来，与其他化 学分离技术相比具有很大的优越性。
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6.从简化提纯步骤着手
如从鸽肝中提取乙酰化酶，需 将动物饥饿后取材，可减少肝糖 原，以简化纯化步骤。
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7．对生物技术产品宿主菌或细 胞的要求
选择生物技术产品的宿主受体菌或 细胞也应考虑到后处理的问题。如用 大肠杆菌表达，由于其不能将所表达 的蛋白质分泌到体外，故提取时必须 破壁，增加了提取的困难，而且还可 能含有毒素类有害因子；用枯草杆菌
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2．发育生长阶段 幼年动物的胸腺比较发达，
老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原 料必须采自幼龄动物。
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3．生物状态
动物饱食后宰杀，胰脏中的 胰岛素含量增加，对提取胰岛素 有利，但胆囊收缩素的分泌使胆 汁排空，对胆汁的收集不利。严 重再生障碍性贫血症患者尿中的 EPO （ erythropoietin, 红 细 胞 生 成素）含量增加。
7
3．许多生物活性物质，一旦离开了生物 体内环境，很易变性及被破坏，应十分注 意保护这些化合物生物的活性，常选择
生化分离技术
生化分离技术生化分离技术是一种利用生物学特性对物质进行分离的技术。
它是现代生物技术和化学工程的交叉领域，广泛应用于生物制药、环境保护、食品加工等领域。
本文将从生化分离技术的原理、应用和前景等方面进行阐述。
一、生化分离技术的原理生化分离技术主要利用生物体内的生物分子之间的相互作用力，如亲和性、电荷、分子大小等，来实现对物质的分离。
其中，亲和层析、电泳和膜分离是常用的分离方法。
亲和层析是利用生物分子之间的特异性相互作用来分离目标物质。
通过将特定配体固定在固定相上，使其与目标物质具有亲和性，从而实现目标物质的选择性吸附和洗脱。
电泳是利用电场作用力将带电粒子在电泳介质中迁移，根据粒子的大小、电荷和形状差异而实现分离。
其中，凝胶电泳是最常见的电泳方法，通过将目标物质分子限制在凝胶中的孔隙中，根据分子大小的不同而进行分离。
膜分离是利用半透膜对物质进行选择性分离。
根据物质在膜上的渗透性差异，通过压力、浓度差或电场等驱动力，将物质从高浓度侧转移到低浓度侧，从而实现分离。
生化分离技术在生物制药领域具有广泛的应用。
例如，利用亲和层析技术可以从复杂的生物样品中纯化重组蛋白、抗体等生物制品。
电泳技术可以用于分离和鉴定DNA、RNA和蛋白质等生物分子。
膜分离技术可以用于浓缩和纯化生物分子，如浓缩血浆中的蛋白质、分离纯化水中的离子等。
生化分离技术还广泛应用于环境保护领域。
例如，利用生物膜反应器可以将废水中的有机物和重金属去除，实现废水的净化。
利用电泳技术可以检测水体中的微量污染物，如农药、重金属等。
利用亲和层析技术可以从环境样品中分离和测定特定的有机物。
生化分离技术还在食品加工、农业和医学诊断等领域有着广泛的应用。
例如，利用膜分离技术可以实现乳制品的浓缩和分离，提高产品的品质和产量。
利用亲和层析技术可以从农产品中分离和测定农药残留。
利用电泳技术可以进行基因检测和疾病诊断。
三、生化分离技术的前景随着生物技术和化学工程的不断发展，生化分离技术也在不断创新和完善。
生化分离原理与技术思考题答案
生物分离原理与技术知识点汇总第一章绪论1、各类分离纯化技术分别利用了生物分子的哪些特性来实现分离？利用这些性质进行分离的方法有哪些？⑴形状和大小:凝胶过滤、超滤、透析;⑵电荷性质:离子交换层析、电泳（除SDS）; ⑶极性（疏水性）:疏水层析、反相层析;⑷生物功能或特殊化学基团:亲和层析;⑸等电点 pI:层析聚焦、等电聚焦、等电点沉淀;⑹溶解性:盐析、有机溶剂提取、结晶;⑺密度、大小:超离心、SDS-PAGE。
2、一个完整的分离纯化操作有哪些基本步骤？各个阶段所用的分离方法分别侧重哪些指标？生化分离基本步骤：（1）选材: 来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少。
（2）提取（预处理）：将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态有关（3）分离纯化: 核心操作，须根据目的物的理化性质，生物学性质及具体条件确定。
（4）浓缩、结晶、干燥。
（5）保存。
整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度）。
第二章生物样品的预处理1、简述常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。
机械法:(1)胞捣碎法。
原理：机械运动产生剪切力，适用于动植物组织。
（2）高速匀浆法。
破碎程度较上法好，且机械剪切力对生物大分子的破坏较小，处理量大。
原理：利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然的减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。
适用于：较柔软、易分散的组织细胞。
（3）研磨法和珠磨法。
由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土。
适用于微生物与植物细胞。
（4）挤压法。
微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎。
适用于细菌（G - ）。
物理法:（1）超声破碎。
频率为20kHz 以上的波，超过人耳可听范围。
其对细胞的破碎与空穴的形成有关。
一般样品浓度、声强、频率、介质的离子强度、pH、处理时间都对破碎有影响。
（2）反复冻融动物材料。
生物分离与纯化技术(生化工艺)第4章 固相析出分离技术
★等电点沉淀法
1.0
在低的离子强度下，调 pH至等电点，使蛋白质 所带净电荷为零，降低 了静电斥力，而疏水力 能使分子间相互吸引， 形成沉淀的操作称为等 电点沉淀 不同的两性电解质具有 不同的等电点，以此为 基础可进行分离。 生产胰岛素时，在粗提 液中先调PH8.0去除碱性 蛋白质，再调PH3.0去除 酸性蛋白质。
3 pH值对盐析的影响
一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，
净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解 度最小。 为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的 等电点处。 注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓 度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整 溶液PH值，以达到最好的盐析效果。
PH＞PI，带负电荷， 又有水膜是稳定的 亲水胶体
+ + +
+
+
+ + + +
H
+
+
_ _
+
_
OH
-
+ +
OH H+
-
+
+ +
中性盐 破坏水膜
_
_ _ _ _ _ _ _ _
中性盐 破坏水膜
中性盐 破坏水膜
+ + + + +
+ + + +
中性盐中和其电荷
中性盐中和其电荷 NH4+或Na+等
SO4 等
高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，
会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀 作用比较少，但回收率会降低。 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加 一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。
生物分离原理与技术
20 世 纪 80 年 代 以 来 ， 人 工 神 经 网 络 （ ANN，Artificial Neural Network）研究所取 得的突破性进展。神经网络控制是将神经网 络与控制理论相结合而发展起来的智能控制 方法。它已成为智能控制的一个新的分支， 为解决复杂的非线性、不确定、未知系统的 控制问题开辟了新途径。
6.1 神经网络发展历史
神经网络的发展历程经过4个阶段。 1 启蒙期（1890-1969年）
1890 年 ， W.James 发 表 专 著 《 心 理 学 》 ， 讨论了脑的结构和功能。
1943年，心理学家W.S.McCulloch和数学家 W.Pitts提出了描述脑神经细胞动作的数学模型 ，即M-P模型（第一个神经网络模型）。
，通过人工模拟人脑的工作机理来实现机器的部
分智能行为。
人工神经网络（简称神经网络，Neural Network）是模拟人脑思维方式的数学模 型。
神经网络是在现代生物学研究人脑组织 成果的基础上提出的，用来模拟人类大脑神 经网络的结构和行为。神经网络反映了人脑 功能的基本特征，如并行信息处理、学习、 联想、模式分类、记忆等。
1绪论
生化分离技术发展的历史和地位 生化分离技术的研究范畴 生化分离技术的应用及发展趋势
1.1 生化分离技术发展的历史和地位
生化分离技术（Separation Methods in Biochemstry or Bioseparation Technique ) ——是描述回收生物产品分离过程原理和方法的 一个术语，是指从动植物组织培养液或微生物发 酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方 法和手段的总称。
生化分离过程是生物技术转化为生产力所不可 缺少的重要环节，其技术的进步程度对于生物 技术的发展有着举足轻重的作用，为突出其在 生物技术领域中的地位和作用，常称它为生物 工程的下游技术（Downstream Processing）。
《生化分离工程》课件
利用离心机的高速旋转产生的离心力 场，使不同密度的物质在离心管内分 层，从而实现分离。
生化分离工程的应用领域
制药工业
生化分离工程在制药工业中应 用广泛，涉及抗生素、蛋白质 、酶等生物药物的分离纯化。
食品工业
在食品工业中，生化分离工程 用于提取植物和动物中的营养 成分，如蛋白质、脂肪、糖类 等。
环保工程
DNA提取与纯化案例
要点一
总结词
通过化学裂解、离心分离和DNA吸附等技术，实现DNA的 提取与纯化。
要点二
详细描述
DNA提取与纯化是生化分离工程中的重要应用之一。化学 裂解和酶消化是常用的DNA提取方法，通过破坏细胞膜和 核膜，释放出DNA。离心分离用于去除细胞碎片和蛋白质 等杂质。DNA吸附技术如硅胶吸附和磁珠吸附等，能够高 效地去除其他杂质，获得高纯度的DNA样品。
将原料的pH值调节至适宜 的范围内，以便后续处理 。
加热与冷却
根据需要加热或冷却原料 ，以改变其物理性质或化 学性质。
细胞破碎
机械破碎
通过高速搅拌、研磨或高 压破碎等方法破坏细胞壁 ，释放细胞内的物质。
酶解破碎
利用酶分解细胞壁，实现 细胞内物质的释放。
化学破碎
利用化学试剂溶解或腐蚀 细胞壁，实现细胞内物质 的释放。
吸附法
利用吸附剂的吸附作用将目标物质从溶液中分离出来 。
浓缩与干燥
蒸发浓缩
通过加热蒸发溶剂，使溶液浓缩至一定体积。
冷冻浓缩
通过降低温度使溶液中的水分结冰，从而实现浓 缩。
干燥
将浓缩后的溶液进行干燥，得到固体产物。
04
生化分离工程设备
离心机
离心机是利用离心力对混合物进行分离的设备，根据其转速和分离原理，可以分为 多种类型，如普通离心机、高速离心机和超速离心机等。
生化分离技术(主要内容)
生化分离技术：描述回收生物产品分离过程原理和方法的术语，是指从动植物组织培养液或微生物发酵液中分离、纯化生物产品过程中所采用的方法和手段的总称。
生化分离过程是生物技术转化为生产力不可缺少的重要环节，其技术进步程度对生物技术的发展有着举足轻重作用，为突出其在生物技术领域中的地位和作用，常称它为生物技术的下游工程。
分离纯化过程的难点：目的产物在细胞或反应液中含量不高，杂质种类多，数量大；杂质性质与产物相似；产物稳定性不高。
生化分离技术的主要种类：沉淀分离（盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、非离子聚合物沉淀）；膜分离（透析、微滤、超滤、纳滤、反渗透）；层析分离（吸附、凝胶、离子交换、疏水、反相、亲和层析）；电泳分离（SDS-PAGE、等电聚焦、双向电泳、毛细管电泳）；离心分离（低速、高速、超速离心分离技术），生化分离的特点：成分复杂；含量甚微；易变性/易被破坏；具经验性；均一性的相对性。
预处理需注意的条件：⑴温度尽可能低⑵提取液的量要保证“充分浸入”⑶加入足量酚类吸附剂⑷加入足量氧化酶抑制剂⑸搅拌转速要恰当⑹pH控制在合适范围，一般5.5～7细胞的破碎：用一定方法（机械/物理/化学/酶法）打开细胞壁或膜，使细胞内含物有效释放出来。
挤压：微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎。
沉淀：溶液中溶质由液相变成固相析出的过程。
本质：通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在液相中的溶解度，增加固相中的分配率。
作用：分离、澄清、浓缩、保存盐溶：低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大。
盐析：中性盐浓度增至一定时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀。
有机溶剂沉淀法：使溶液的介电常数大大降低，从而增加带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉淀；争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，破坏水化层，使分子易碰聚产生沉淀。
生化分离与纯化技术课程标准
生物分离与纯化技术课程标准濮阳职业技术学院刘殿锋一、课程的基本要素1、课程性质生物分离与纯化技术是实现生物工程产业化的关键问题。
通过本课程的学习，对当前生物分离与纯化技术领域的大分子物质提取、分离及纯化技术、沉淀技术、浓缩技术、膜分离技术、生物反应器技术、各种色谱技术、各种电泳技术等有较全面、较详细的了解，并掌握一些主要技术的方案设计和实际操作。
通过案例教学等方法培养学生科学而实际的思想方法，提高分析实际技术问题和因地制宜处理这些问题的能力，使之更加容易胜任生物技术产业中新产品和新工艺的开发，生产工艺过程技术管理和高技术生产岗位的实际技术工作。
2、课程的基本理念以行业和岗位需求为导向，以职业能力培养为中心，根据调研的行业企业任职岗位的要求，参照职业标准，以职业能力培养为课程教学重点和中心环节，充分体现职业性、实践性和开放性的要求。
3、课程的设计思路本课程的设计思路如图所示：第一步，由学校组织专业教师深入企业进行职业岗位调研，获得企业的岗位职业标准；第二步，学校和企业合作，由学校专业教师、企业专家、企业工程技术人员、能工巧匠共同组成课程设计小组，对经过职业岗位调研获得的岗位职业标准，结合生化产品分离纯化工等国家职业标准进行工作任务分析，以岗位需求为依据，以职业能力为主线，得出职业能力需求表，体现职业性的要求；第三步，课程开发小组合作进行基于工作过程的课程开发与设计，以工作过程为基础，以工作实践为起点，体现实践性的要求，设计出生物分离与纯化技术的课程教学标准；第四步，课程开发小组依据课程标准，组织开发设计课程教学所需的各类教学资源，包括：教材、课件、习题、企业生产案例、实训实习项目、学生学习指南、教学指导手册、实习实训标准及指导手册等，满足课程的教学需求；第五步，课程开发小组依据课程标准和教学资源进行教学过程设计，采取示范教学、案例分析、分组讨论、引导启发等多种教学方法，引导学生积极思考、乐于实践，提高教和学的效果；根据学生的学习效果，结合学生通过真实的生物产品分离纯化工作体验后对课程教学新要求的信息反馈，再进行职业岗位调研、工作任务分析、课程内容设计、教学资源开发、教学过程设计五个步骤新一轮的循环，体现开放性的要求，使课程内容保持与企业需求的一致性，不断满足学生发展的需求。
生物化学实验技术(2)常用分离技术
二．硫酸铵的使用
硫酸铵中常含有少量的重金属离子， 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基 有敏感作用，使用前必须用H 处理： 有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓 溶液，通入H 饱和，放置过夜， 溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离 浓缩结晶，100℃烘干后使用 烘干后使用。 子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 ），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH 右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。
第三节 其他沉淀法一．Fra bibliotek电点沉淀法 二．生成盐复合物沉淀法 三． 选择性变性沉淀 四．非离子多聚物沉淀法
一．等电点沉淀法
两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低， 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后，等 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 值。 等电点法常与盐析法、 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用，以提高其沉淀能力。 合使用，以提高其沉淀能力。
使用硫酸铵时： 使用硫酸铵时：
1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种， ）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有 ℃或室温两种， 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种 ）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（ 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或 ）盐析后一般放置半小时至一小时， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫 酸铵密度较大， 酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。
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2．来源丰富易得； 3．制造工艺简单易行；
4．成本比较低；
5．经济效果要好。
如蛋白质原料的选择 蛋白质类生化产品的原料来 源有动植物组织和微生物等，原 则是 无害生物材料。
对天然蛋白质生化产品，为提 高其质量、产量和降低生产成本， 对原料的种属、发育阶段、生物状 态、来源、解剖部位、生物技术产 品的宿主菌或细胞都有一定的要求， 了解这些，可使分离纯化工作事半 功倍，反之则收效甚微。
一、机械法
主要通过机械力的作用，使组织 粉碎。粉碎少量原料时，可使用高 速组织捣碎机（ 10 000r ／ min ）、 匀浆器、研钵、研船等。工业生产 上一般常用的粉碎设备有电磨机、 球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击 碎机等。
7．对生物技术产品宿主菌或细 胞的要求
选择生物技术产品的宿主受体菌或 细胞也应考虑到后处理的问题。如用 大肠杆菌表达，由于其不能将所表达 的蛋白质分泌到体外，故提取时必须 破壁，增加了提取的困难，而且还可 能含有毒素类有害因子；用枯草杆菌
或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛 盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖 基化等翻译及修饰的缺陷；用动物细 胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决 后处理及完整表达的问题。 用肿瘤细胞作宿主细胞制成的生 化产品还应考虑到其安全性，制造体 外诊断用试剂则是很好的高产方法。
5．原料解剖学部位
猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而 胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则 可提高各产品的收率。
胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白 酶 (pepsin) 则以采取胃底部粘膜为好， 因胃底部粘膜富含消化酶。
6.从简化提纯步骤着手
如从鸽肝中提取乙酰化酶，需 将动物饥饿后取材，可减少肝糖 原，以简化纯化步骤。
3．生物状态
动物饱食后宰杀，胰脏中的 胰岛素含量增加，对提取胰岛素 有利，但胆囊收缩素的分泌使胆 汁排空，对胆汁的收集不利。严 重再生障碍性贫血症患者尿中的 EPO （ erythropoietin, 红 细 胞 生 成素）含量增加。
4．原料来源
血管舒缓素可分别从猪胰脏 和猪颚下腺中提取，两者生物学 功能并无二致，而稳定性以颚下 腺来源为好，因其不含蛋白水解 酶。
生 化 物 质 的 制 备
一般从天然生物材料制作生化物质 的过程大体可分为六个阶段：
1.原料的选择和预处理 2.原料的粉碎；
3.提取，即从原料中经溶剂分离有效成分， 制成粗品 的工艺过程；
4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉 淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、 结晶等步骤进行精制的工艺过程；
思考题（课前设疑）
1.如何保持生化物质的生物活性？一般 生化物质在碱性条件下容易变性，还是 在酸性条件下容易变性？
2.一般从天然生物材料制作生化物质的 过程大体可分为几个阶段？ 3.在制备生化物质前应如何选择原料？
4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在 应用上有何区别？ 5.对酸性物质的提取，常在什么条件下进 行？对碱性物质的提取，常在什么条件 下进行？对两性物质的提取，常在什么 条件下进行？ 6.以细丙为例解释提取制备每步的基本 原理？
5.干燥及保存；
6.成品及.制剂，即半成品或原料药 经精细加工制成片剂、口服液、针 剂、冻干剂等供饮用或临床应用的 各种剂型。 利用生化制备技术从生物材料中 获得特殊的生物活性物质，如蛋白质、 酶、激素、核酸等生化产品时，通常 要注意以下几个问题：
1．生物材料的组成成分非常复杂， 有数百种甚至更多，各种化合物 的形状、大小、相对分子质量和 理化性质都各不相同，有的迄今 还是未知物，而且这些化合物在 分离时仍在不断的代谢变化中。
十分温和的条件，尽可能在较低温度和洁 净环境中进行。一般来说制备的操作时间 长、手续较繁琐。因为许多大分子在分离 过程中，过酸、过碱、重金属离子、高温、 剧烈的机械作用、强烈的辐射和机体内自 身酶的作用，均可破坏这些分子的结构或 生理活性。
4 ．生化分离制备过程几乎都在溶 液中进行，各种温度、 pH 、离子强 度等参数，对溶液中各种组成的综 合影响，常常无法固定，有些实验 或工艺的设计理论性不强，常带有 很大的经验成分。因此，要建立重 复性好的成熟工艺，对生物材料、 各种试剂及其辅助材料等都要严格 地加以规定。
原料的粉碎
在提取前先将大块的原料粉碎 或绞碎成适用的粒度，或将细胞 破碎，使胞内生物活性物质充分 释放到溶液中，有利于提取或吸 附。不同的生物体或同一生物体 不同的组织，其破碎的难易不一 样，使用的方法也不完全相同。 动物的脏器组织，
常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质 组织可以磨碎；许多微生物均具有 坚韧的细胞壁，常用自溶、冷热交 替、加砂研磨、超声波、加压处理 等破碎方法。如果提取的有效成分 是体液或细菌胞外某些多肽激素、 酶等，则不需要破碎细胞。
1．种属
牛胰含胰岛素（ isulin) 单位比 猪胰高，牛为 4000 IU ／ kg 胰脏， 猪为 3000 IU ／ kg 胰脏。抗原性则 猪胰岛素比牛胰岛素低，前者与人 胰岛素相比，只有 1 个氨基酸的差 异，而牛有3个氨基酸的差异。
2．发育生长阶段 幼年动物的胸腺比较发达， 老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原 料必须采自幼龄动物。
2．在生物材料中，有些化合物 含量很低或极微，有的只有1／l0 000， 甚至更少。制备时，原材料用量很 大，得到产品很少，与投料量相比 “虎头蛇尾”。近年来，用所谓 “钓鱼法”，利用某些分子特有的 专一亲和力，将某一化合物从极复 杂的体系中“钓”出来，与其他化 学分离技术相比具有很大的优越性。
3 ．许多生物活性物质，一旦离开了生物 体内环境，很易变性及被破坏，应十分注 意保护这些化合物生物的活性，常选择
5．生化制备方法最后均一性的证明 与化学上纯度的概念并不完全相同， 这是由于生物分子对环境反应十分 敏感，结构与功能的关系比较复杂， 评定其均一性时，要通过不同角度 测定，才能得出相对“均一性”结 论，只凭一种方法所得纯度的结论， 往往是片面的，甚至是错误的。
原料选择和预处理
选什么样的原材料应视生产目的而定。 一般要注意以下几个方面: 1．要选择有效成分含量高的新鲜材料；