第5章+细胞培养++讲义

第五章细胞培养

单细胞培养体系的建立为研究植物细胞的特征和潜能性提供了一个极好的机会。这种培养体系有助于揭示多细胞有机体中细胞之间的相互关系和相互影响。Haberlandt的开创性实验没能使游离细胞实现细胞分裂，但他1902年发表的研究论文激发了对这一个领域的进一步研究。随后，几位研究者相继报道了促使游离单细胞分裂，甚至从单细胞培养再生完整植株的研究结果，都获得了令人瞩目的成功。植物生物技术研究者对细胞培养具有浓厚的兴趣，他们认识到，通过细胞培养生产天然产物比培养完整器官或完整植株有更多的优点。利用细胞培养研究分析细胞代谢的途径，是最初吸引植物生物学家注意的另一个研究课题。人们不久便认识到，单细胞培养体系对农作物改良具有很大的应用潜力。在培养游离细胞的过程中，可以让各种化学药品和放射性物质很快地作用于细胞，又很快地停止这种作用，从而易于诱导和筛选培养细胞突变体。通过单细胞的克隆化，可以把微生物遗传学技术用于高等植物以进行农作物的改良。此外，在特定的生长周期和培养条件下，培养细胞群体中的单个细胞能稳定地表现细胞遗传和新陈代谢的变异，这种变异被称为空间异质性。这是一项非常有趣的研究，因为将在单细胞再生植株形态发生的过程中，证实细胞间染色体组型和积累次生代谢产物的能力是否存在差异。细胞系筛选技术可适用于培育高产细胞系和优良农业性状的株系。

l单细胞的分离

1.1由完整的植物器官分离单细胞

分离单细胞的最佳材料是叶组织，因为叶片中的细胞近似于一个同质细胞群体，很适合用于特定和调控的大规模细胞培养。用机械法或酶解法可以从这种完整植物体器官(如叶组织)分离出单细胞。1.1.1机械法

叶组织是分离单细胞的最好材料。Ball、Joshi和Noggle等曾先后由花生成熟叶片得到了离体单细胞。他们所用的方法是，先撕去叶表皮，使叶肉细胞暴露，然后再用小解剖刀把细胞刮下来。这些离体细胞可直接在液体培养基(成分见p92表6.2)中培养。在培养中很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。以上是关于由完整的植物器官中获得的游离细胞能在人工培养基里进行分裂的最早报道。但不是所有植物叶片都能通过这种方法得到单细胞。上述人员就没能从所试验过的大多数其他植物的叶片中分离出活细胞。

现在广泛用于分离叶肉细胞的方法是先把叶片轻轻研碎，然后再通过过滤和离心把细胞净化。具体做法是：在研钵中放人10 g叶片和40 ml研磨介质(20μmol蔗糖，10μmol MgCl2，20μmol tris-HCl 缓冲液，pH值7.8)，用研杆轻轻研磨。之后，将匀浆用两层细纱布过滤，在研磨介质中以低速离心将得到的细胞净化。除了双子叶植物外，很多单子叶植物(其中可能包括禾本科植物，但尚未证明)也能通过这个方法产生完整的叶肉细胞。应用类似方法后人由马唐中分离出具有代谢活性的叶肉细胞和维管束鞘细胞，由菠菜中分离出叶肉细胞，由篱天剑、石刁柏等叶片中分离大量游离薄壁细胞，由大豆子叶分离出了活细胞。

和酶解法相比，用机械法分离细胞至少有两个明显的优点：①细胞不受酶的伤害；②不会发生质壁分离。这点对生理和生化研究来说是很理想的。一般用机械法分离的细胞能够发生分裂并形成愈伤组织。但这种机械分离细胞的方法并不普遍适用，只有在薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

1.1.2酶解法

利用果胶酶(pectase)处理植物叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。Takebe等(1968)最早报道了由烟草叶片通过果胶酶处理分离叶肉细胞的方法（p98～99，附录6.2）：首先取烟草植株上充分展开的叶片进行表面消毒，无菌蒸馏水冲洗干净，用镊子撕去下表皮，用解剖刀将撕去下表皮的叶片切成4cm×4cm 的小块，放人经过过滤灭菌的酶液(含果胶酶0.5％+甘露醇0.8％+硫酸葡聚糖钾1％)中，用真空泵抽气，使酶液渗入叶肉组织内。在摇床上保温培养，每30min更换一次酶液，将第一次30min后换出的酶液弃掉，第二次30min后，酶液中主要分离出海绵薄壁细胞，第三和第四次以后主要分离出栅栏细胞。

Takebe等(1968)证明，在离析混合液中加入硫酸葡聚糖钾可作为原生质膜的稳定剂，降低酶液中核糖核酸酶的活力，保持质膜稳定性，提高游离细胞的产量。用于分离细胞的果胶酶不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。因此，用酶解法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞的胀裂。如果所用的甘露醇的浓度低于0.3mol／L，烟草原生质体将会在细胞壁内崩解。酶解法分离细胞能

得到较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。但在有些物种中，特别是大麦、小麦、玉米等单子叶植物中，很难通过酶解法使细胞分离，因为与双子叶植物相比，这些植物的叶肉细胞较长，并在若干地方发生收缩，细胞间可能形成一种互锁结构，阻止细胞的分离。

1.2由培养组织中分离单细胞

用于基础研究和应用研究的单细胞系统，在传统上常常是由离体培养的组织分离得到的，因为这个途径不但方便，而且广泛适用。只要把由经过表面消毒的器官上刚刚切取下来的一小块组织，置于含有适当比例的生长素和细胞分裂素的培养基上，即可建立起组织培养物。在这样一种培养基上，外植体愈伤组织化。这个过程一般是由切口开始，逐渐扩展到接种组织的整个表面。把愈伤组织由外植体上剥离，转移到成分相同的新鲜培养基上，促使愈伤组织生长，这个过程称做继代培养(subculture)。通过反复地在琼脂培养基上继代，不但可使愈伤组织不断增殖，扩大数量，而且还能提高愈伤组织的松散性，这对于在液体培养基中建立充分分散的细胞悬浮培养物是非常必要的。然而Wilson和Street(1975)观察到，当把新切取下来的橡胶树愈伤组织转移到液体培养基中并加以搅动时，愈伤组织只能破碎成小块，想由此建立高度分散的细胞悬浮液的努力全部归于失败。于是他们又把在液体培养基中生长的愈伤组织块转回到琼脂培养基上。两个月后形成了很易散碎的愈伤组织，当把这些愈伤组织再转移到液体培养基中以后，产生了很好的悬浮液。

由愈伤组织获得游离细胞的具体做法是，把未分化的和易散碎的