分子生物技术在临床细菌学检验中的应用
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DNA extraction rep-PCR DNA fingerprinting kits
• Microfluidics chips and reagent kits
• Web-based Software with the Agilent 2100 bioanalyzer
BioMerieux
DIVERSILAB™ advantages are:
PCR产物纯化测序 GenBank中进行物种序列比较
给出鉴定报告
PCR产物分析：有 or 无 给出药敏报告
DNA指纹技术应用于细菌同源性分析
微生物实验室在每日的工作中面临着：
准确而及时的检验报告 快速报告相关结果 准确解释耐药机制 为院内感染控制提供准确信息
“谁主张，谁举证”
手术伤口感染！&？ 导管相关血流感染！&？ 呼吸机相关肺炎！&？
• 核酸序列检测和DNA指纹技术属发展较快 的前沿技术，对微生物种群分类、基因结 构分析、流行病学研究均具有较高的实用 价值。
DNA/RNA、PCR、 sequencing
……
PFGE、repPCR
……
PCR技术
分子生物学技术 的核心与基础
标本采集、核酸分离纯化、 PCR与sequencing、同源性 分析、核酸探针、基因重 组、蛋白质（分离、印迹 分析、探针）技术以及生 物信息学技术
血浆、血清、全血、脑脊液、痰液、粪便
40min 24/ 个样品（ easyMAG系统）
45 min 12 /个样品（mini MAG 系统）
微生物实验室在每日的工作中面临着：
准确而及时的检验报告 快速报告相关结果 准确解释耐药机制 为院内感染控制提供准确信息
直接使用标本 提取DNA or RNA
针对细菌N基因或基因间隔区进行PCR
核酸扩增技术
应用
多重PCR 多重PCR
PCR
PCR
对mecA基因检测 对mecA基因检测 自溶酶和青霉素结合酶的检测 M蛋白基因的菌株分型
PCR
尿道分泌物标本直接检测
PCR、巢式PCR
临床标本检测
PCR、SDA、Qbeta 肺结核诊断、临床标本直接检测
PCR
鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的区别
PCR
产毒菌株的检测
多重PCR
产毒菌株检测
PCR
耐药质粒分型和检测
多重PCR
胃活检组织细菌检测
PBaidu NhomakorabeaR
菌株分型
PCR
通过16s rRNA鉴定
多重PCR
生殖道溃疡病人的直接检测
PCR
与爆发相关菌株的分型
PCR
临床标本鉴定
PCR
通过“DNA”指纹鉴定
多重PCR
生殖道溃疡标本直接检测
巢式PCR
治疗前、中、后检测
PCR
钩端螺旋体血清型的鉴定
×
√
临床微生物检验
Why ？
快！！！ 准！！！
• VITEK-2 Compact 是生物-梅里埃公司开发 的新一代微生物分析仪，其工作原理与 VITEK 系列产品没有大的差别。
• 微生物鉴定准确可靠。
• 鉴别细菌耐药性，提高对临床用药指导。
• VITEK-2高级专家系统通过利用“指纹图” 判读，确立耐药表型，推导细菌耐药机制。
证据！
细菌同源性 VS 细菌分型
病原学诊断 细菌鉴定 菌种、药敏
细菌分型
表型
血清型 耐药性 ……
基因型
细菌同源性分析
• Genotyping methods have became increasingly important in clinical microbiology laboratories.
PCR
分型
PCR
无症状病人的诊断
分子生物学技术在细菌药敏试验中的应用
检测的耐药基因
1. β-内酰胺类: mecA、blaTEM、blaROB-1、blaSHV、blaIMP、blaMIR-1、blaOXA、 blaPER-1、blaPER-2、blaOXY-1、blaOXA-10/11。
2. 氨基糖苷类: aph（3’）—Ⅲ、aph（3’）—Ⅵ、ant（2〃）Ia、ant（4’）-Ia、aac（3） -Ia、acc（6’）-Ia、aac（3）-Va、aac（6’）-aph（2〃）、ant（4’）、ant（6’）-Ia、 aac（6’）-Ic、aac（3）-Ib、aad（2〃）-Ia、ant（6）-I、aph（2〃）-Ic。
• NucliSENS® easyMAG™ 平台是生物梅里埃公司第二代仁 全自动核酸提取系统, 它利用硅胶技术(亦名BOOM®技术) 于临床标本中是提取核酸。
• NucliSENS® mini MAG™ 使用专利Boom®核酸提纯技术 （金标方法），配合新一代磁性硅胶进行核酸提纯，适用 于从不同类型的标本中提纯DNA和RNA。
分子生物技术在临床细菌学检 验中的应用
谢轶 华西医院实验医学科
临床微生物实验室 2009-12
• 微生物实验室在控制合理使用抗生素、制定治疗方案以 及相应诊断的决策方面扮演了关键角色。恰当的目标治 疗方案也依赖于可靠的微生物检测结果。
• 持续增多的细菌耐药性不断挑战着目前仍然有效的抗生 素治疗方案。 只有尽早检出耐药性才可能采取积极措 施和调整治疗,以避免治疗的失败。
核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用
微生物种类
金黄色葡萄球菌 凝固酶阴性葡萄球菌 肺炎链球菌 化脓性链球菌 淋病奈瑟菌 百日咳杆菌 结核分枝杆菌 鸟分枝杆菌复合群 白喉棒状杆菌 肠致病性大肠埃希菌 伤寒、副伤寒沙门菌 幽门螺杆菌 小肠结肠炎耶尔森菌 弯曲菌属 杜克雷嗜血杆菌 嗜肺军团菌 金氏杆菌属 念珠菌属 梅毒螺旋体 伯氏螺旋体 问号状钩端螺旋体 CDC group Ⅳ 群 沙眼衣原体
3. 氯霉素: catP、catQ、catD、catI 4. 环内酯类: ereA、ereB、ermA、ermAM、ermC、ermF、smp、mphA、mefA、vat。 5. 磺胺类: sulⅠ、sulⅡ,sulA。 6. 四环素: tet（A）、tet（C）、tet（D）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（O）、
-Integrated platform -Consistent and reproducible profiles -Improved reproducibility and discrimination
when compared to manual rep-PCR. -High throughput applications and efficiency
自动化技术 VS 分子生物学技术
×
√
临床微生物检验
微生物实验室在每日的工作中面临着：
• 准确而及时的检验报告 √
× • 快速报告相关结果
• 准确解释耐药机制
× × • 为院内感染控制提供准确信息
自动化技术在微生物检验中的应用
• 微生物数码鉴定法
生产厂商 API20A
可鉴定的微生物 孵育时间及条件
核酸序列检测在微生物检验中的应用
“未培养出病原菌”的感染标本？ 1.标本病原菌数量少或受抗生素影响， 2.难或不能培养的微生物导致。
PCR检测特点：
1.标本用量少、直接针对微生物特异DNA片段
2.无需培养再现病原体
3.直接在标本中采用PCR技术对病原体做定性或定性+定量的检测
PCR技术可以直接应用到原始样品的检验，但直接测序不易成功。 • 序列分析是确定病原微生物的金标准，但成为常规检验项目难。 • 原因： • “1.PCR技术的假阳性或假阴性结果多见； • 2.核酸分离分析技术需要经验丰富的实验人员和必要的设备投入； • 3.每一种微生物基因组均有自身特有的结构和组成，在分析方法和技巧上差别较大……” • 原因： • 贵！
tet（P）、tet（S）、tet（Q）、tet（U）、tetA（P）。 7. 甲氧苄啶: dhfrⅠ、dhfrⅡ、dhfrⅢ、dhfrⅤ、dhfrⅦ、dhfrⅨ、dhfrⅩ、dfrA、folH、
dhfrⅧ。 8．糖肽类: vanA、vanB、vanB2, vanC1、vanC3、vanD。 9．喹诺酮类: gyrA、gyrB、parE。 10．乙胺丁醇: embB。 11．吡嗪酰胺: pncA。 12．利福平: rpoB。 13．链霉素: rpsL、rrs。 14．异烟肼: katG、inhA、ahpC。
expensive
rep-PCR具有高分辨力、简单易行、良好的重复性等特点，因此将成 为最佳的病原微生物分型的首选技术。 PFGE分辨力高，能获得最佳分型结果，但耗时长、技术复杂。 研究中也许可以使用一种以上的分型技术，让一种技术的缺点会被 其他技术的优点所代替，达到理想的效果。
• Rep-PCR目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类， 此方法操作方便，可以大样本进行。REP-PCR分辨效果好， 可重复性强，比 RFLP、生化分型，核糖体分型要好。 REP-PCR目前可自动化分型，并可建立各种细菌REP、 ERIC-PCR分型标准数据库。
DiversiLab System Advanced Microbial Genotyping
细菌同源性研究 －分子生物学方法
• 脉冲场凝胶电泳（PFGE） • 多位点重复序列分析（rep-PCR）
Pulsed Field Gel Electrophoresis PFGE 脉冲场凝胶电泳
rep-PCR技术
• rep-PCR：Versalovic于1996年描述的一种细菌基因组指纹 分析方法，即细菌基因组重复序列PCR技术（rep-PCR） 是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，通过电泳条 带比较分析，揭示基因组间的差异。细菌基因组中广泛分 布的短重复序列（repetitive sequence），它们在菌株、种、 属水平上分布有差异及进化过程有相对保守性。
厌氧菌
24h 厌氧
API 20Strep(Rapid STREP) 链球菌、肠球菌
4~24h
API 20C AUX
酵母菌
48~72h
……
• 全自动的微生物鉴定和药敏试验分析系统
1．VITEK 系统 2. MicroScan Walk/ Away系统 3．PHOENIXTM 系统 ……
生物表型 VS 生物基因型
• 近年来，在控制院内获得性感染方面，微生物检测的作 用已显得更加突出。通过预报和监测院内感染，微生物 学家们成为各相关医疗机构对抗细菌耐药的先锋。
• 在这种充满挑战性的环境下，微生物检测必须以最快且 有效的方式提供最好的服务。
微生物实验室在每日的工作中面临着：
• 准确而及时的检验报告 • 快速报告相关结果 • 准确解释耐药机制 • 为院内感染控制提供准确信息
rep-PCR TECHNOLOGY
STRAIN ANALYSIS
Role of Diversilab
• Result faster than PFGE, Discriminatory power Diversilab= PFGE • Discriminatory power Diversilab> Ribotyping • Surveillance of nosocomial spreading • Confirmation in national reference lab. • In comparison with antibiotic resistance testing Diversilab relatively
Genotyping methods
• Plasmid analysis • Restriction endonuclease analysis • PCR assays • Multiplex assys • Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE) • Multilocus sequence typing (MLST) • Pulsed-field electrophoresis (PFGE) • DNA seuquencing • SNPs pyrosequencing • Ribotyping • PCR ribotyping • Restriction fragment length polymorphism (RFLP) • Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) • Amplified fragment length polymorphism (AFLP) • Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR)
• Microfluidics chips and reagent kits
• Web-based Software with the Agilent 2100 bioanalyzer
BioMerieux
DIVERSILAB™ advantages are:
PCR产物纯化测序 GenBank中进行物种序列比较
给出鉴定报告
PCR产物分析：有 or 无 给出药敏报告
DNA指纹技术应用于细菌同源性分析
微生物实验室在每日的工作中面临着：
准确而及时的检验报告 快速报告相关结果 准确解释耐药机制 为院内感染控制提供准确信息
“谁主张，谁举证”
手术伤口感染！&？ 导管相关血流感染！&？ 呼吸机相关肺炎！&？
• 核酸序列检测和DNA指纹技术属发展较快 的前沿技术，对微生物种群分类、基因结 构分析、流行病学研究均具有较高的实用 价值。
DNA/RNA、PCR、 sequencing
……
PFGE、repPCR
……
PCR技术
分子生物学技术 的核心与基础
标本采集、核酸分离纯化、 PCR与sequencing、同源性 分析、核酸探针、基因重 组、蛋白质（分离、印迹 分析、探针）技术以及生 物信息学技术
血浆、血清、全血、脑脊液、痰液、粪便
40min 24/ 个样品（ easyMAG系统）
45 min 12 /个样品（mini MAG 系统）
微生物实验室在每日的工作中面临着：
准确而及时的检验报告 快速报告相关结果 准确解释耐药机制 为院内感染控制提供准确信息
直接使用标本 提取DNA or RNA
针对细菌N基因或基因间隔区进行PCR
核酸扩增技术
应用
多重PCR 多重PCR
PCR
PCR
对mecA基因检测 对mecA基因检测 自溶酶和青霉素结合酶的检测 M蛋白基因的菌株分型
PCR
尿道分泌物标本直接检测
PCR、巢式PCR
临床标本检测
PCR、SDA、Qbeta 肺结核诊断、临床标本直接检测
PCR
鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的区别
PCR
产毒菌株的检测
多重PCR
产毒菌株检测
PCR
耐药质粒分型和检测
多重PCR
胃活检组织细菌检测
PBaidu NhomakorabeaR
菌株分型
PCR
通过16s rRNA鉴定
多重PCR
生殖道溃疡病人的直接检测
PCR
与爆发相关菌株的分型
PCR
临床标本鉴定
PCR
通过“DNA”指纹鉴定
多重PCR
生殖道溃疡标本直接检测
巢式PCR
治疗前、中、后检测
PCR
钩端螺旋体血清型的鉴定
×
√
临床微生物检验
Why ？
快！！！ 准！！！
• VITEK-2 Compact 是生物-梅里埃公司开发 的新一代微生物分析仪，其工作原理与 VITEK 系列产品没有大的差别。
• 微生物鉴定准确可靠。
• 鉴别细菌耐药性，提高对临床用药指导。
• VITEK-2高级专家系统通过利用“指纹图” 判读，确立耐药表型，推导细菌耐药机制。
证据！
细菌同源性 VS 细菌分型
病原学诊断 细菌鉴定 菌种、药敏
细菌分型
表型
血清型 耐药性 ……
基因型
细菌同源性分析
• Genotyping methods have became increasingly important in clinical microbiology laboratories.
PCR
分型
PCR
无症状病人的诊断
分子生物学技术在细菌药敏试验中的应用
检测的耐药基因
1. β-内酰胺类: mecA、blaTEM、blaROB-1、blaSHV、blaIMP、blaMIR-1、blaOXA、 blaPER-1、blaPER-2、blaOXY-1、blaOXA-10/11。
2. 氨基糖苷类: aph（3’）—Ⅲ、aph（3’）—Ⅵ、ant（2〃）Ia、ant（4’）-Ia、aac（3） -Ia、acc（6’）-Ia、aac（3）-Va、aac（6’）-aph（2〃）、ant（4’）、ant（6’）-Ia、 aac（6’）-Ic、aac（3）-Ib、aad（2〃）-Ia、ant（6）-I、aph（2〃）-Ic。
• NucliSENS® easyMAG™ 平台是生物梅里埃公司第二代仁 全自动核酸提取系统, 它利用硅胶技术(亦名BOOM®技术) 于临床标本中是提取核酸。
• NucliSENS® mini MAG™ 使用专利Boom®核酸提纯技术 （金标方法），配合新一代磁性硅胶进行核酸提纯，适用 于从不同类型的标本中提纯DNA和RNA。
分子生物技术在临床细菌学检 验中的应用
谢轶 华西医院实验医学科
临床微生物实验室 2009-12
• 微生物实验室在控制合理使用抗生素、制定治疗方案以 及相应诊断的决策方面扮演了关键角色。恰当的目标治 疗方案也依赖于可靠的微生物检测结果。
• 持续增多的细菌耐药性不断挑战着目前仍然有效的抗生 素治疗方案。 只有尽早检出耐药性才可能采取积极措 施和调整治疗,以避免治疗的失败。
核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用
微生物种类
金黄色葡萄球菌 凝固酶阴性葡萄球菌 肺炎链球菌 化脓性链球菌 淋病奈瑟菌 百日咳杆菌 结核分枝杆菌 鸟分枝杆菌复合群 白喉棒状杆菌 肠致病性大肠埃希菌 伤寒、副伤寒沙门菌 幽门螺杆菌 小肠结肠炎耶尔森菌 弯曲菌属 杜克雷嗜血杆菌 嗜肺军团菌 金氏杆菌属 念珠菌属 梅毒螺旋体 伯氏螺旋体 问号状钩端螺旋体 CDC group Ⅳ 群 沙眼衣原体
3. 氯霉素: catP、catQ、catD、catI 4. 环内酯类: ereA、ereB、ermA、ermAM、ermC、ermF、smp、mphA、mefA、vat。 5. 磺胺类: sulⅠ、sulⅡ,sulA。 6. 四环素: tet（A）、tet（C）、tet（D）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（O）、
-Integrated platform -Consistent and reproducible profiles -Improved reproducibility and discrimination
when compared to manual rep-PCR. -High throughput applications and efficiency
自动化技术 VS 分子生物学技术
×
√
临床微生物检验
微生物实验室在每日的工作中面临着：
• 准确而及时的检验报告 √
× • 快速报告相关结果
• 准确解释耐药机制
× × • 为院内感染控制提供准确信息
自动化技术在微生物检验中的应用
• 微生物数码鉴定法
生产厂商 API20A
可鉴定的微生物 孵育时间及条件
核酸序列检测在微生物检验中的应用
“未培养出病原菌”的感染标本？ 1.标本病原菌数量少或受抗生素影响， 2.难或不能培养的微生物导致。
PCR检测特点：
1.标本用量少、直接针对微生物特异DNA片段
2.无需培养再现病原体
3.直接在标本中采用PCR技术对病原体做定性或定性+定量的检测
PCR技术可以直接应用到原始样品的检验，但直接测序不易成功。 • 序列分析是确定病原微生物的金标准，但成为常规检验项目难。 • 原因： • “1.PCR技术的假阳性或假阴性结果多见； • 2.核酸分离分析技术需要经验丰富的实验人员和必要的设备投入； • 3.每一种微生物基因组均有自身特有的结构和组成，在分析方法和技巧上差别较大……” • 原因： • 贵！
tet（P）、tet（S）、tet（Q）、tet（U）、tetA（P）。 7. 甲氧苄啶: dhfrⅠ、dhfrⅡ、dhfrⅢ、dhfrⅤ、dhfrⅦ、dhfrⅨ、dhfrⅩ、dfrA、folH、
dhfrⅧ。 8．糖肽类: vanA、vanB、vanB2, vanC1、vanC3、vanD。 9．喹诺酮类: gyrA、gyrB、parE。 10．乙胺丁醇: embB。 11．吡嗪酰胺: pncA。 12．利福平: rpoB。 13．链霉素: rpsL、rrs。 14．异烟肼: katG、inhA、ahpC。
expensive
rep-PCR具有高分辨力、简单易行、良好的重复性等特点，因此将成 为最佳的病原微生物分型的首选技术。 PFGE分辨力高，能获得最佳分型结果，但耗时长、技术复杂。 研究中也许可以使用一种以上的分型技术，让一种技术的缺点会被 其他技术的优点所代替，达到理想的效果。
• Rep-PCR目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类， 此方法操作方便，可以大样本进行。REP-PCR分辨效果好， 可重复性强，比 RFLP、生化分型，核糖体分型要好。 REP-PCR目前可自动化分型，并可建立各种细菌REP、 ERIC-PCR分型标准数据库。
DiversiLab System Advanced Microbial Genotyping
细菌同源性研究 －分子生物学方法
• 脉冲场凝胶电泳（PFGE） • 多位点重复序列分析（rep-PCR）
Pulsed Field Gel Electrophoresis PFGE 脉冲场凝胶电泳
rep-PCR技术
• rep-PCR：Versalovic于1996年描述的一种细菌基因组指纹 分析方法，即细菌基因组重复序列PCR技术（rep-PCR） 是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，通过电泳条 带比较分析，揭示基因组间的差异。细菌基因组中广泛分 布的短重复序列（repetitive sequence），它们在菌株、种、 属水平上分布有差异及进化过程有相对保守性。
厌氧菌
24h 厌氧
API 20Strep(Rapid STREP) 链球菌、肠球菌
4~24h
API 20C AUX
酵母菌
48~72h
……
• 全自动的微生物鉴定和药敏试验分析系统
1．VITEK 系统 2. MicroScan Walk/ Away系统 3．PHOENIXTM 系统 ……
生物表型 VS 生物基因型
• 近年来，在控制院内获得性感染方面，微生物检测的作 用已显得更加突出。通过预报和监测院内感染，微生物 学家们成为各相关医疗机构对抗细菌耐药的先锋。
• 在这种充满挑战性的环境下，微生物检测必须以最快且 有效的方式提供最好的服务。
微生物实验室在每日的工作中面临着：
• 准确而及时的检验报告 • 快速报告相关结果 • 准确解释耐药机制 • 为院内感染控制提供准确信息
rep-PCR TECHNOLOGY
STRAIN ANALYSIS
Role of Diversilab
• Result faster than PFGE, Discriminatory power Diversilab= PFGE • Discriminatory power Diversilab> Ribotyping • Surveillance of nosocomial spreading • Confirmation in national reference lab. • In comparison with antibiotic resistance testing Diversilab relatively
Genotyping methods
• Plasmid analysis • Restriction endonuclease analysis • PCR assays • Multiplex assys • Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE) • Multilocus sequence typing (MLST) • Pulsed-field electrophoresis (PFGE) • DNA seuquencing • SNPs pyrosequencing • Ribotyping • PCR ribotyping • Restriction fragment length polymorphism (RFLP) • Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) • Amplified fragment length polymorphism (AFLP) • Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR)