药物转录组学
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盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结 构
④检测分析
1. 激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 2. 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交 点的信号 3. 软件进行进行图象分析和数据处理
2.基因表达系列分析
• 基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）是通过快速和详细分析 成千上万个EST（express sequenced tags）来 寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列， 从而比较完整地获得基因组的表达信息。 • SAGE能够快速、全范围提取生物体基因表 达信息，对已知基因进行量化分析。SAGE 也能应用于寻找新基因。
样品制备
样品分离纯化
DNA , mRNA
扩增
PCR, RT—PCR，固相PCR
标记
荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标 记
分子杂交
样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。 与经典分子杂交的区别： 1. 杂交时间短，30分钟内完成 2. 可同时平行检测许多基因序列
影响杂得到的标签数据进行分析处理。在所测 得序列中的每个双标签体之间由锚定酶序列相间 隔，每一标签序列是否出现以及出现的频率将代 表基因是否表 达以及表达的水平。一般一个测序 反应的结果可得到约20个双标签体，亦即包含了 约40个转录本的信息。
（三）转录组学（ transcriptomics ） 是在整体水平上研究细胞编码基因转录 情况及转录调控规律的科学。
转录组学研究方法： 1.基因芯片技术 2. 基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 3.大规模平行信号测序系统 4. RNA测序技术
• EST（Expressed Sequence tags，表达序列 标签 ）是从已建好的cDNA库中随机抽取克 隆，从5’末端或3’末端对插入的cDNA片段 进行一轮单向自动测序，所获得的约60500bp的一段cDNA序列。
SAGE的主要依据
• 第一，一个9～10碱基的短核苷酸序列标签 包含有足够的信息，能够唯一确认一种转 录物。 • 第二，如果能将9碱基的标签集中于一个克 隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸 顺序以连续的数据形式输入计算机中进行 处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行 分析。
技术方法
• (1) 首先将cDNA 模板体外“克隆”到直径5μm 的微球体上。“克隆”的方法主要是利用人工设 计长度不同的两类互补寡核苷酸,分别与 cDNA 模板和微球体连接之后,再将cDNA 模板 与微球体连接起来。为了能装载下细胞内所 有的cDNA 模板(若以3～4 ×104 个基因计算) , 寡核苷酸的数量至少应该要比模板的量多100 倍以上。
• 芯片实验室是生物芯片技术发展的 . 3. 4. 5. 6. 操作简单 自动化程度高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本较低
DNA芯片技术步骤
芯片制备
实性材料：硅芯片、玻片和瓷片 需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基 活性基团。 膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜 通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸
第八章 药物转录组学
第一节
转录组学概述
（一）转录组（transcriptome）指生 命单元（通常是一种细胞）所能转录出 来的可直接参与蛋白质翻译的mRNA（编
码RNA）总和，而其他所有非编码RNA
均可归为RNA组（RNome）。
（二）转录组与基因组的关系
1.转录组来自于基因组,量小得多但重要（人类 基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有3 万个基因转录成mRNA分子，转录后的mRNA 能被翻译生成蛋白质的也只占整个转录组的 40%左右）。 2.转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同 一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基 因表达情况是不完全相同的。
SA dT为引物将mRNA反转录合 成双链cDNA，经锚定酶（Anchoring Enzyme, AE）酶（如Nla Ⅲ、Sau3AⅠ等）切后收集 cDNA的3’端部分。
anchor 锚，靠山 synthesis 综合物 zyme酶，病菌 enzyme酶
• ②将收集的3’端cDNA等分为两部分，分 别同接头A、B相连接。每一种接头的结 构都由PCR扩增引物A或B的序列、标签 酶识别位点和锚定酶识别位点三部分组 成。
• 标签酶（Tagging Enzyme, TE）是一种IIS 类限制性内切酶，如BsmF I等，它在距 识别位点下游约20bp的位置切割DNA双 链。
• ③连接产物以标签酶酶切后用Klenow酶补 平5’突出端，得到两组分别带有接头A、B的 短cDNA片段（约50bp）。混合并连接两组 短cDNA片段，形成一个约100bp的双标签体 （ditag）群，并以引物A和B对其进PCR扩增。
ample充足的amplifiy增强 放大
• ④用锚定酶切割扩增产物，分离纯化去除 接头后的双标签体（约26bp），并使之相 互连接成为大片段的连测序系统
• 大规模平行信号测序系统MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)是以基因 测序为基础的新技术，其方法学基础是一个 标签序列（10-20bp）含有能够特异识别转录 子的信息，标签序列与长的连续分子连接在 一起，便于克隆与序列分析。通过定量测定可 以提供相应转录子的表达水平，也就是将 mRNA的一端测出一个包含10-20个碱基的标 签序列，每一个标签序列在样品中的频率（拷 贝数）就代表了与该标签相应的基因表达水 平。
1.基因芯片技术
• 基因芯片（gene chip）又称 DNA 芯片， 指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400 ）探针分子固定于支持物上后与标记 的样品分子进行杂交，通过检测每个探针 分子的杂交信号强度进而获取样品分子的 数量和序列信息。
• 按用途分
– 表达谱芯片 – 诊断芯片 – 指纹图谱芯片 – 测序芯片 – 毒理芯片
④检测分析
1. 激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 2. 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交 点的信号 3. 软件进行进行图象分析和数据处理
2.基因表达系列分析
• 基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）是通过快速和详细分析 成千上万个EST（express sequenced tags）来 寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列， 从而比较完整地获得基因组的表达信息。 • SAGE能够快速、全范围提取生物体基因表 达信息，对已知基因进行量化分析。SAGE 也能应用于寻找新基因。
样品制备
样品分离纯化
DNA , mRNA
扩增
PCR, RT—PCR，固相PCR
标记
荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标 记
分子杂交
样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。 与经典分子杂交的区别： 1. 杂交时间短，30分钟内完成 2. 可同时平行检测许多基因序列
影响杂得到的标签数据进行分析处理。在所测 得序列中的每个双标签体之间由锚定酶序列相间 隔，每一标签序列是否出现以及出现的频率将代 表基因是否表 达以及表达的水平。一般一个测序 反应的结果可得到约20个双标签体，亦即包含了 约40个转录本的信息。
（三）转录组学（ transcriptomics ） 是在整体水平上研究细胞编码基因转录 情况及转录调控规律的科学。
转录组学研究方法： 1.基因芯片技术 2. 基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 3.大规模平行信号测序系统 4. RNA测序技术
• EST（Expressed Sequence tags，表达序列 标签 ）是从已建好的cDNA库中随机抽取克 隆，从5’末端或3’末端对插入的cDNA片段 进行一轮单向自动测序，所获得的约60500bp的一段cDNA序列。
SAGE的主要依据
• 第一，一个9～10碱基的短核苷酸序列标签 包含有足够的信息，能够唯一确认一种转 录物。 • 第二，如果能将9碱基的标签集中于一个克 隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸 顺序以连续的数据形式输入计算机中进行 处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行 分析。
技术方法
• (1) 首先将cDNA 模板体外“克隆”到直径5μm 的微球体上。“克隆”的方法主要是利用人工设 计长度不同的两类互补寡核苷酸,分别与 cDNA 模板和微球体连接之后,再将cDNA 模板 与微球体连接起来。为了能装载下细胞内所 有的cDNA 模板(若以3～4 ×104 个基因计算) , 寡核苷酸的数量至少应该要比模板的量多100 倍以上。
• 芯片实验室是生物芯片技术发展的 . 3. 4. 5. 6. 操作简单 自动化程度高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本较低
DNA芯片技术步骤
芯片制备
实性材料：硅芯片、玻片和瓷片 需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基 活性基团。 膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜 通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸
第八章 药物转录组学
第一节
转录组学概述
（一）转录组（transcriptome）指生 命单元（通常是一种细胞）所能转录出 来的可直接参与蛋白质翻译的mRNA（编
码RNA）总和，而其他所有非编码RNA
均可归为RNA组（RNome）。
（二）转录组与基因组的关系
1.转录组来自于基因组,量小得多但重要（人类 基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有3 万个基因转录成mRNA分子，转录后的mRNA 能被翻译生成蛋白质的也只占整个转录组的 40%左右）。 2.转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同 一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基 因表达情况是不完全相同的。
SA dT为引物将mRNA反转录合 成双链cDNA，经锚定酶（Anchoring Enzyme, AE）酶（如Nla Ⅲ、Sau3AⅠ等）切后收集 cDNA的3’端部分。
anchor 锚，靠山 synthesis 综合物 zyme酶，病菌 enzyme酶
• ②将收集的3’端cDNA等分为两部分，分 别同接头A、B相连接。每一种接头的结 构都由PCR扩增引物A或B的序列、标签 酶识别位点和锚定酶识别位点三部分组 成。
• 标签酶（Tagging Enzyme, TE）是一种IIS 类限制性内切酶，如BsmF I等，它在距 识别位点下游约20bp的位置切割DNA双 链。
• ③连接产物以标签酶酶切后用Klenow酶补 平5’突出端，得到两组分别带有接头A、B的 短cDNA片段（约50bp）。混合并连接两组 短cDNA片段，形成一个约100bp的双标签体 （ditag）群，并以引物A和B对其进PCR扩增。
ample充足的amplifiy增强 放大
• ④用锚定酶切割扩增产物，分离纯化去除 接头后的双标签体（约26bp），并使之相 互连接成为大片段的连测序系统
• 大规模平行信号测序系统MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)是以基因 测序为基础的新技术，其方法学基础是一个 标签序列（10-20bp）含有能够特异识别转录 子的信息，标签序列与长的连续分子连接在 一起，便于克隆与序列分析。通过定量测定可 以提供相应转录子的表达水平，也就是将 mRNA的一端测出一个包含10-20个碱基的标 签序列，每一个标签序列在样品中的频率（拷 贝数）就代表了与该标签相应的基因表达水 平。
1.基因芯片技术
• 基因芯片（gene chip）又称 DNA 芯片， 指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400 ）探针分子固定于支持物上后与标记 的样品分子进行杂交，通过检测每个探针 分子的杂交信号强度进而获取样品分子的 数量和序列信息。
• 按用途分
– 表达谱芯片 – 诊断芯片 – 指纹图谱芯片 – 测序芯片 – 毒理芯片