黑曲霉发酵生产纤维素酶实验1

黑曲霉发酵生产纤维素酶实验

一、实验目的

1、了解纤维素酶的生产工艺和原理

2、掌握液体发酵和固体发酵工艺

3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理

二、实验原理

纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。

以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。

三、材料与试剂配制

1、生产菌种：黑曲霉

2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。

3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2O = 7.0 g/L ;NH4NO3= 1 g/L ;KCl

= 0.7 g/ L ; NaH

2PO

4

= 2.0 g/ L ;Na

2

HPO

4

=3.0 g/ L ,pH7.4。

4、微量元素液：FeSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L，

ZnSO

4· 7H

2

O 1.4mg/L，CoCl

2

2.0mg/L，加蒸馏水200ml使之溶解。

5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源 3 g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1 g，蛋白胨0.05g作有机氮源，人工海水100 ml（含1%微量元素液），自然pH值。

6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5 g，人工海水

12 ml（含1%微量元素液，1%氯化铵或硫酸铵，0.05%蛋白胨），自然pH值。

7、6% DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500ml水中，加热溶解，于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6g，20.8gNaOH,5g苯酚，5g无水亚硫酸钠，加热搅拌溶解，冷却后定容至1000ml。储存在棕色瓶中放置一周后使用。（提前配制）

8、0.1 mol/L 柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液（pH 4.8）

（1）0.1mol/L柠檬酸钠溶液100mL:称2.941克柠檬酸钠(柠檬酸钠的分子量为294.12)，约20L蒸馏水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。

（2）0.1mol/L柠檬酸溶液100mL:称 2.101克柠檬酸(柠檬酸的分子量为210.14)，约20L蒸馏水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。

（3）pH4.8的柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液100mL:量取0.1mol/L柠檬酸钠溶液54mL和0.1mol/L柠檬酸溶液46mL混合摇匀。

9、1%CMC-Na溶液

称取1.0克羧甲基纤维素纳，用pH 4.8的柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液加热溶解。

10、1mg.mL-1标准葡萄糖溶液

1mg/mL葡萄糖溶液250mL:准确称取无水葡萄糖250mg，溶解定容到250ml。

四、主要仪器

恒温培养箱，摇床培养箱，可见光分光光度计、冷冻离心机、电子天平等。

五、实验步骤

1、培养基配制

分别按上述方法配制液体发酵培养基和固体发酵培养基，121℃灭菌20分钟。

2、孢子悬液的制备

将斜面培养基上的曲霉孢子用少量无菌人工海水洗下，利用玻璃珠在磁力搅拌下搅拌15~20分钟，充分打散孢子，稀释成5x107个/ml左右的孢子悬液。

3、液体发酵产酶试验

按6%（v/v ）接种量将浓度约为5×10 7 个/ml的菌株孢子悬液接入已灭菌

的液体发酵培养基（150 ml 锥瓶装液100 ml），于35℃、180r/min条件下摇床培养5天。发酵液4℃、5000 r/min离心15 min，上清液稀释5倍，测定发酵液中的酶活力。

4、固体发酵产酶试验

100 ml三角烧瓶装5g已灭菌的固体发酵培养基，按1:3(v/w)接种量将浓度约为5×10 7 个/ml的菌株孢子悬液，于35℃恒温培养箱中培养，接种48小时后隔天翻曲一次，第四或第五天补充无菌水保持基质水分。培养5天后，取发酵成熟曲1g，加蒸馏水10ml，搅拌均匀，30℃，浸提lh，双层纱布过滤，滤液经4℃，

在0.2~1.0范5000rmp离心15min，上清为粗酶液。测定时适当分级稀释，使OD

540

围。

5、酶活力测定及酶活力定义

（1）葡萄糖标准曲线绘制

准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。分别吸取此液1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 ml至5个25ml的比色管中，用蒸馏水定容到25ml(即加水24, 23, 22, 21, 20ml)

再分别吸取上溶液各 2.5ml于比色管中（糖液分别含糖量为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg），各加2.5mlDNS试剂，煮沸5min。（对照管2.5ml水

。

代替糖液，冷却，测定OD

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表1 葡萄糖标准曲线绘制加样表

管号 1 2 3 4 5 6

蒸馏水（mL） 2.5 - - - - -

标准葡萄糖

- 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 （mL）

DNS（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

含糖量（mg）0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD540

为纵坐标，（或反过来）绘制标准曲线。

以糖含量为横坐标，A

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（1）内切葡聚糖酶 (CMCase) 酶活：取适当稀释的酶液0.5 ml，加入2.0 ml