菌种选育

2.2.2.4 介绍几种物理、化学诱变剂的使用方法
A 紫外线 紫外线是一种使用时间较久、值得推广的诱变剂， 它的辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好，故应用 最广泛，研究得也最多。虽然紫外线的波长范围很宽， 但对诱变最有效的波长仅仅是260 nm左右（253－265） nm一般诱变时用菌（孢子）悬浮液进行处理，紫外 灯的功率为15W，距离固定在30 cm左右。 紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以 改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。
（2）诱发突变 敏感菌株先经诱变因素处理，然后将 处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培 养基上，经诱变后的存活孢子中，如存在抗性变异菌 株就能在此平板上生长。这种菌落生长的速度一般与 正常菌落的生长速度相近，诱变可以提高抗性菌株的 频率。
除上述方法外，还可将敏感菌孢子经诱变后接入 种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继 续培养几天，再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬 菌体所裂解，最后取再生菌丝进行平板分离，从中筛 选抗性菌株。
2.2.2.2 诱变育种的一般步骤
• 诱变育种的一般步骤见P38，如图2－2所示 • 注意事项：选择好出发菌株；正确和灵活 使用各种诱变剂；诱变剂的选择；变异株 的筛选和筛选条件的确立；高产菌株的获 得与筛选条件的配合。 • 具体内容详见40页。
2.2.2.3 诱变育种工作中几个应注意的问题
A 选择好出发菌株 选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。 有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用 强。如果用这种菌株于生产是很有益的，而用作出 发菌株则不适宜。 用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生 理等方面有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量 高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱 变剂的使用及筛选条件。
染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易 位、逆位、重复等。
基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化 （又称点突变）。 根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突 变。 自然突变是指在自然条件下出现的基因突变。 诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基 因突变。诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和 生物的三大类，见P38表2-6。经诱变处理后，微生物 的遗传物质、DNA和RNA的化学结构发生改变，从 而引起微生物的遗传变异。
2.2.3 抗噬菌体菌株的选育
2.2.3.1噬菌体的分布 凡是有寄主细胞的地方，一般容易找到它们的噬菌 体。 2.2.3.2 抗噬菌体菌株的选育
在工业微生物发酵过程中，有不少品种遭受噬菌体 的感染，使生产不能进行。这种瓦解细胞的噬菌体称 为烈性噬菌体。在出现噬菌体以后必须选育抗噬菌体 菌株和配合其他措施使生产继续进行。由于噬菌体很 易发生变异，因此又会出现新的噬菌体，对噬菌体原 具有抗性的菌株又会出现不抗。所以既要不断收集噬 菌体，又要不断选育新的抗性菌株，以确保生产正常 进行。
D 亚硝酸
亚硝酸是一种常用的有效诱变剂，其诱变作用主 要是脱去碱基中的氨基。例如A、C、G分别被脱去 氨基而成为次黄嘌呤（H）、尿嘧啶（U）、黄嘌呤 （Ⅹ）等。复制时，它们分别与C、A、C配对。前 两种情况可以引起碱基对的转换而造成突变。此外， 亚硝酸还会引起DNA两条链之间的交联而造成DNA 结构上的缺失。
E 高产菌株的获得需要筛选条件的配合
在诱变育种过程中高产菌株的获得还必须有合适 的筛选条件的配合，如果忽视这一点，则变异后的高 产菌株不可能被挑选出来。 诱变与筛选可以说是一个问题的两个方面，必须 用辩证的观点来看待。只重视诱变而忽视筛选，或过 份重视菌种而忽视发酵条件的观点都是片面的，这样 会影响高产菌株的获得。 总之，在诱变育种过程中要正确处理出发菌株， 诱变因素和筛选条件三者的关系。全面辩证地考虑上 述三者之间的关系，将是诱变育种能否获得理想效果 的重要关键。
B 快中子
中子是原子核的组成部分、是不带电荷的粒子， 可由回旋加速器、静电加速器或原子反应堆产生。中 子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核 射出质子来，因而快中子的生物学效应，几乎完全是 由质子造成的。受中子照射的物质所射出的质子是不 定向的，照射后产生的电离，则集中在受照射物体内 沿着质子的轨迹上。 中子分为快中子和慢中子。快中子的能量为0.2－10 百万电子伏特，慢中子的能量为l／40－100电子伏特。 慢中子的效应同α射线、γ射线和电子等照射时引起的 基本相同，快中子较X射线、γ射线具有较大的电离密 度因而能更多地引起点突变和染色体畸变。
2.2.1 自然选育
在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然 突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。
所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下 所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原 因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。所 谓多因素低剂量的诱变效应，是指自然突变实质上是 由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效 应。所谓互变异构效应是指四种碱基的第六位上的酮 基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或 烯醇式出现，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式 或亚氨基式出现。平衡一般倾向于酮式和氨基式。碱 基对发生自然突变的机率约为10－8一10－9。
B 复合诱变因素的使用
在微生物诱变育种中，可利用各种物理、化学 诱变因素来处理菌种。对野分型菌株单诱变因素有 时也能取得好的效果，但对老菌种单一诱变因素重 复使用突变的效果不高，这时可利用复合因素来扩 大诱变幅度，提高诱变效果。例如：青霉素的选育。
C 剂量选择
各种诱变因素有它们各自的诱变剂量单位，如紫 外线剂量单位用焦耳，x一射线剂量单位是库（仑） 每千克，中子剂量单位是戈。化学诱变因素一般是 以溶液浓度死率取决于诱变剂量，而致死 率和变异率之间有一定关系。因此可以用致死率作 为选择适宜剂量的依据。
B 抗噬菌体菌株的特性试验
无论从自然突变或诱发突变所得到的抗噬菌体菌 株，在用于生产之前，均需经过反复验证，才能使用。
（l）抗噬菌体性状的稳定性试验 抗性菌株分别在孢 子培养、种子培养和发酵培养过程中用点滴法或双层 琼脂法测定噬菌斑。如都不出现噬菌斑，说明该菌株 对此噬菌体具有抗性。此外，还可以观察抗性菌株经 多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。
2.2菌种选育
菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微 生物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产 品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌 种，从而促进生产发展。
所以，育种工作者要充分掌握微生物学、生物化 学、遗传学的基本原理和国内外有关的先进科学技术， 灵活而巧妙地将其运用到育种中去，使菌种选育技术 不断更新和发展。 目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法， 带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。随着微 生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转导、原 生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种 方法。
E N一甲基一N′硝基一N一亚硝基弧（NTG）
亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发 营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12％一80％ 的营养缺陷型菌株，故有超诱变剂之称。它在pH低 于5－5.5的条件下，形成HNO2 而引起菌种突变；在 碱性条件下以重氮甲烷的形式对DNA起烷化作用； 在pH6时，两者均不产生，此时的诱变效应可能是由 于NTG本身对核蛋白体引起的变化所致。 在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因 此用甲酰胺溶解NTG，可以提高处理浓度。通常在 浓度为300 μg／mL，温度为28℃和时间为60分钟的 条件下进行处理，容易得到高产菌株。
剂量范围约为100－1500戈。快中子在诱变育种中有 较好的效果，近年来国内已广泛应用。由于剂量测量 还不统一，不同反应堆或其他中子源所放射的快中子 能量亦不同。因此，诱变结果也很不一致，为此，国 际原子能组织已提倡推广标准化的照射装置。
C氮芥
氮芥是一种极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色 粉末，一般使用它的盐酸盐。应用时先使氮芥盐酸盐 与碳酸氢钠起作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作 用而造成变异。氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸 变，氮芥盐酸盐在碳酸氢钠溶液中呈游离状态，甘氨 酸能与氮芥（在碳酸氢钠参与下）结合，形成无毒化 合物，因此它有解毒作用。其反应式见P40，氮芥使 用方法见P41。
自然选育是一种简单易行的选育方法，它可以达到 纯化菌种，防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目 的。但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢。因 此，经常把自然选育和诱变育种交替使用，这样可以 收到良好的效果。
自然选育（自然分离）的一般程序，是把菌种制备 成单孢子悬浮液，经过适当的稀释以后，在固体平板 上进行分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定， 经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的 菌株。
在发生噬菌体感染时发酵罐排出的废气夹带有大 量噬菌体，造成严重污染和扩散。因此，必须在排气 口及下水道喷洒药剂，防止噬菌体扩散。常用的药物 有漂白粉、甲醛、石灰水等。种子室应尽量设法与外 界减少接触，严格执行无菌操作，并检查空气中有无 噬菌体存在。在噬菌体感染期间，车间内亦要定时检 查噬菌体的分布情况，采取有效措施直至消灭为止。
优良菌种应具备的特征： 对菌种的要求：天然菌种的生产性能较低，一般需要进 行选育。 1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢 产物的产量高，其它代谢产物少 2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化 4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素 选择生产菌种应注意的因素： 1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、 抗噬菌体能力强，遗传特性稳定 4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。
2.2.3.3 噬菌体的防治
不同发酵类型遭到不同种类噬菌体侵染所出现的现 象是不同的，而同一菌种被相同的噬菌体侵染，由于 侵染的时间不同，也会造成不同的后果。但都会出现 畸形菌丝，菌体迅速消失，pH上升，发酵产物停止积 累，甚至下降等现象。
噬菌体的防治是多方面的。大概可以分以下几个方 面：
（1）正确判断 （2）普及有关噬菌体的知识 （3）选育抗噬菌体菌株 （4）消灭噬菌体
细菌的抗性是基因突变的结果，抗噬菌体突变可 以发生在接触噬菌体以前，它和噬菌体的存在与否无 关。
A 抗噬菌体菌株选育的几种才法 根据基因突变规律，可采用自然突变和诱发突变 等方法获得。 （1）自然突变 以噬菌体为筛子，敏感菌株的孢子不 经任何诱变由其自然突变为抗性菌株，这种方法获得 的抗性突变频率很低。
（2）抗性菌株的产量试验 在选育抗噬菌体菌株时， 既要求具有抗性，同时亦要求生产能力不低于原敏感 菌株。
（3）其正抗性与溶源性的区别试验 菌株的抗噬菌体 特性具有遗传的相对稳定性。 抗性表现力多种多样，可因细胞壁结构的改变而阻 止噬菌体吸附侵入，也可因生理代谢的改变，使噬菌 体不能侵染，即使侵染后也不能增殖释放。这些菌株 都具有真正的抗性。溶原性菌株则因细胞中存在原噬 菌体，对同一类型噬菌体具有免疫性。表面上看来， 这种菌株具有抗性，但可采用物理、化学因素诱导不 同的敏感菌看它是否会释放噬菌体。出现噬菌斑的菌 株就是溶源菌，而不是真正抗性菌。
D 变异菌株的筛选
诱变育种工作的一个主要任务是获得高产变异菌 株。从经诱变的大量个体中挑选优良菌种不是一件容 易的事。因为不同的菌种表现的变异形式是不同的， 一个菌种的变异规律去发现那些与产量有关的特性， 并根据这些特性，分门别类地挑选一定数最的典型菌 株进行发酵和鉴定，以确定各种类型与产量之间的 关系。这样，可大大提高筛选的工作效率。
2.2.2诱变育种
2.2.2.l 诱变育种的基本原理
诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由 于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。 诱发突变是在诱变剂作用下，变异幅度大大提高。
常用的诱变剂分物理，化学和生物诱变剂。紫外线、 快中子、激光等是物理诱变剂；碱基类似物（嘌啉、 嘧啶等）、与碱基反应的物质（亚硝基胍、羟胺等）、 是化学诱变剂；噬菌体等是生物诱变剂。