关于酶切的有用知识

关于酶切的有用知识

酶切是分子生物学中常用的，如何选择酶切缓冲液，提高酶切效率，是一个十分关键的问题，本人摘用了其它论坛的内容，另外将逐步整理，使酶切问题能够比较容易解决，希望大家补充：

1.PCR产物的酶切。

PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料:

2.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑：（1）酶切缓冲液。每

种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg 等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油

和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：

（A）使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见公司网站，如NEB提供了很好的buffer参数:

/neb/tech/tech_resource/restriction/buffers/buffer_chart.html。

（B）

使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的BUFFER怎么办呢？

分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损

失大；

（C）克隆到T载体中，值得推荐的方法，克隆到T载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。

（2）酶切温度。酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反应温度不同，如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。

（3）酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min就可以酶切完全，建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。

（4）酶失活。如

果使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。这种情况较少见，只能换新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer也不一样，怎么办？放心，可以用不同公司的酶

进行双酶切，一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的buffer，每个公司生产的酶反应缓冲液针对

特定内切酶是最合适的！

(5）酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段DNA，酶切后产物量较少，可以增加酶切重组DNA的量和

增加上样量，建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓，做到心中有数。

一、1ug DNA用的酶不超过10U（10个单位），初次做的话你可以先测DNA浓度，然后做酶切。

二、如二楼所说，直接切PCR产物，你的引物两端酶切位点之外应有1-3个保护性碱基（如GGG），这样才能有效的酶切。

三、关于酶切体系，我常用20ul体系如下：

DNA 8.6ul

Enzyme A 0.2ul

Enzyme B 0.2ul

10 × buffer 2.0ul

ddH2O 9ul

不过这是我检测的体系。酶切回收的话可以用50ul或者100ul体系，可以同比例放大。四、当然这个体系不是固定的，因为不同酶的浓度也不同。有些酶还要注意星星活性。

以上为个人拙见，仅供参考。

把PCR装到T载体再酶切效率高；注意PCR产物酶切时间要长些，过夜酶切。