富血小板血浆提取方法的探讨_王悦
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实用口腔医学杂志（ J Pract Stomatol） 2011 Sep，27（ 5）
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富血小板血浆提取方法的探讨
王悦 朱喆 刘昕鸣 马英智 周延民 杨旭芳
【摘要】 目的： 比较不同离心和激活方法处理富血小板血浆（ PRP） 的效果。方法： 1 名健康志愿者、30 名眼科住院患者静脉 采血，分别用 PCCSkit 法，Curasan 法及 Trindade 法制备 PRP。ELISA 检测各组血小板衍化生长因子（ PDGF） 、转化生长因子 （ TGF-β） 、血管内皮细胞生长因子（ VEGF） ，倒置相差显微镜观察 PRP 添加方式对人成骨样细胞 MG63 观察效果的影响。结 果： Trindade 离心法提取的 PRP 加 CaCl2 后，PDGF 含量高于其他 2 种方法，PCCSkit 法提取的 PRP 加 CaCl2 和凝血酶后，TGFβ 含量高于其他 2 种方法，Curasan 法提取的 PRP 加 CaCl2 后，VEGF 浓度高于其他 2 种方法。3 种离心方法中未激活和激活 的 PRP 中生长因子浓度差异有显著性（ P ＜ 0． 05） ，激活组中 CaCl2 组和 CaCl2 加凝血酶组 PRP 中生长因子含量差异无显著性 （ P ＞ 0． 05） 。显微镜观察显示，PRP 离心后的萃取液可去除 RBC 对 MG63 细胞观察效果的影响。结论： 3 种离心方法间无显 著差异； 低温、即刻提取 PRP，用 CaCl2 或 CaCl2 加凝血酶激活均促进生长因子释放； PRP 离心萃取液更有利于用于细胞培养 中的镜下观察。
浓度为（ 1． 0 ～ 1． 5） × 1012 / L，符合实验要求。3 种离 心方法提取 PRP 后，每种方法又分 3 组： 第 1 组未激 活 PRP； 第 2 组只加 10% CaCl2 激活； 第 3 组加含凝血 酶 500 U / ml 的 10% CaCl2 激活［5］。2 种激活剂均按 9∶1（ v / v） 与 PRP 混合，室温静止 10 min，离心 12 000 r / min，5 min，提取萃取液。ELISA 方法比较不同离心 方法 获 得 的 PRP 经 激 活 处 理 后 其 PDGF、TGF-β、 VEGF 的浓度差异。 1． 2． 2 离心温度比较 抗凝全血分 2 组，每组 5 份， PCCS kit 法提取 PRP，第 1 组常温离心，第 2 组低温离 心控度 20 ℃ 。测量离心管表面温度，比较 2 组差异。 提取 PRP 后，按 9∶1（ v / v） 含凝血酶 500 U / ml 的 10% CaCl2 混合，静 置 10 min，常 温 离 心 12 000 r / min，5 min，提取 PRP 萃取液，比较 2 组的量。 1． 2． 3 保存方法比较 实验分 2 组，PCCS kit 法提取 PRP，第 1 组 2 次离心后即刻加含凝血酶 500 U / ml 的 10% CaCl2 ，12 000 r / min，5 min； 第 2 组 2 次离心后 － 80 ℃ 冻存，实验时，室温溶化后加相同激活剂，同法 高速离心。比较 2 组 PRP 的性状。 1． 2． 4 细胞实验中 PRP 添加方式比较 对数生长期 MG63，胰酶消化，离心 1 000 r / min，5 min，细胞悬液密 度 5 × 104 / ml。24 孔板，每孔加细胞悬液 500 μl。A 组即刻加未激活未离心的 PRP、每孔 25 μl，B 组即刻 加未激活已离心的 PRP、每孔 25 μl，倒置相差显微镜 观察细胞形态。 1． 3 统计学方法
1 材料和方法
1． 1 主要试剂与材料 人成骨样细胞株 MG63 购自中科院上海生物研究
所，CaCl2 （ 北京生化） ，hPDGF、hTGF-β，hVEGF ELISA 试剂盒（ RD，美国） ，10% 胎牛血清（ PAA，奥地利） ，高 糖 DMEM 培养基（ Gibco，美国） ，人凝血酶、胰蛋白酶 （ 鼎国生物） 。常温台式离心机（ 菲恰尔 TDL-4A 型， 上海生物分析仪器有限公司） ，全能台式高速冷冻离 心机（ Thermo，德国 ） ，温度计（ 数字式电子体温计，东 阿阿胶阿华医疗器械有限公司） ，倒置相差显微镜（ Olympus IX70，日本） ，CO2 孵箱（ Thermo，德国） ，无菌采 血管（ 江苏康健） ，超净工作台（ 苏州安泰空气技术有 限公司） ，酶标仪（ BIO-RAD 680 型，日本） 。 1． 2 方法
基金项目： 吉林省科学技术厅项目（ 编号： 200804423） 作者单位： 130021 长春，吉林大学口腔医院种植中心（ 王悦 周延民） ；
吉林大学白求恩医学院病理系（ 朱喆 马英智 杨旭芳） ； 吉 林大学口腔医院第二临床医院检验科（ 刘昕鸣） 通讯作者： 周延民 0431-88796025 E-mail： zhouym62@ 126． com
【Key words】 Platelet-rich plasma； Growth factor； Preparation methods 中图分类号： R331． 1 + 43 文献标识码： A doi： 10． 3969 / j． issn． 1001 － 3733． 2011． 05． 013
Βιβλιοθήκη Baidu
目前，组织工程骨构建与生长因子应用研究多采
【关键词】 富血小板血浆； 生长因子； 制备方法
Comparison of the methods for the preparation of platelet-rich plasma WANG Yue1 ，ZHU Zhe2 ，LIU Xinming3 ，MA Yingzhi2 ，ZHOU Yanmin1 ，YANG Xufang2 ． 1． 130021 Changchun， Department of Implant Center，School of Stomatology，Jilin University，China； 2． Department of Pathobiology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun； 3． Clinical laboratory，The Second Clinical Hospital of Jilin University，Changchun
【Abstract】Objective： To compare the effects of different methods for the preparation of platelet-rich plasma （ PRP） ． Methods： Venous blood was obtained from a health volunteer and 30 patients of the department of ophthalmology． PRP was prepared by PCCS system，Curasan system and Trindade method respectively． The levels of PDGF，VEGF and TGF-β in the PRP samples were measured using ELISA． A phase contrast microscope was used to observe the morphology of MG63 cells cultured with PRP． Results： PDGF level in the PRP prepared by Trindade method and treated with CaCl2 was higher，TGF-β level in PRP prepared by PCCS and treated with CaCl2 and thrombase was higher，the concentration of VEGF in PRP prepared by Curasan and treated by CaCl2 was higher． CaCl2 increased PDGF level in the PRP prepared by Trindade method，TGF-β by PCCS and Curasan，and VEGF by the three methods（ P ＜ 0． 05） ，but the two activation methods showed no statistics significance（ P ＞ 0． 05） ． Centrifuged PRP did not affect the observation of the morphology of cultured MG63 cells． Conclusion： Three methods are effective in the prepariation of PRP． Preparation at low temperature and activation of PRP by CaCl2 or CaCl2 plus thrombin may increase the cytokin content． Centrifuged PRP is suitable for cell culture．
用单一或几个生长因子与材料复合，其中生长因子制 备复杂、成 本 高，受 保 存 条 件 及 免 疫 原 性 局 限。1993 年，Ganio 等［1］将人血浆中提取的富血小板血浆（ platelet-rich plasma，PRP） 用于促进伤口愈合，并指出其潜 在的临床前景。PRP 是患者自体血离心提取的血小板 含量比正常全血高 4 ～ 5 倍的血浆。体外血小板与
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实用口腔医学杂志（ J Pract Stomatol） 2011 Sep，27（ 5）
CaCl2 、凝血酶混合后被激活，其中 α 颗粒释放多种生 长因子如： 血小板源生长因子 （ platelet-derived growth factor，PDGF） 、转化生长-β（ transforming growth factor， TGF-β） 、血 管 内 皮 生 长 因 子 （ vascular endothelial growth factor，VEGF） 、表皮生长因子（ epithelial growth factor，EGF） 、类胰岛素生长因（ insulin-like growth factor，IGF） 、成纤维细胞生长因子 （ fibroblast growth factor，FGF） 等，各因子间发挥协同作用，但机制尚不清。 PRP 因制备简便，价格低，无免疫原性，成为临床理想 的生长因子源。故有必要就 PRP 制备过程的注意事 项，不同离心方法对 PRP 中生长因子含量的影响进行 研究，为阐明 PRP 的生物学机制提供技术方法。
从离心速度、激活方法、离心温度、保存方法等四 方面，探讨 PRP 制备的注意事项； 从 PRP 添加方式对 MG63 镜下观察的影响，探讨 PRP 细胞水平的应用。 1． 2． 1 离心速度、激活方法比较 1 名健康志愿者及 30 名眼 科 住 院 患 者 静 脉 采 血，分 别 采 用： PCCS kit 法［2］，美国 3i 种植公司机采 PRP 设备的离心方法即第 1 次离心 3 000 r / min，3 min 45 s； 第 2 次 3 000 r / min， 13 min。Curasan 法，德国 Kleinostheim 公司机采 PRP 设备的离心方法，第 1 次离心，2 400 r / min，10 min； 第 2 次，3 600 r / min，15 min。Trindade-suedam IK 等报道 的方法（ Trindade 法） ［3］： 第 1 次离心 1 600 r / min，10 min； 第 2 次离心 5 000 r / min，5 min。离心后三者采取 同样的方式提取 PRP，第 1 次离心后收集全部血浆层、 白膜层及 2 ～ 3 mm 范围的红细胞层移至另一采血管； 第 2 次 离 心 后 抽 取 3 /4 血 浆 层，即 贫 血 小 板 血 浆 （ platelet-pool plasma，PPP ） ，余 下 的 1 /4 即 PRP［4］， － 80℃ 冻存。3 种方法离心获得的 PRP 经检验血小板
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富血小板血浆提取方法的探讨
王悦 朱喆 刘昕鸣 马英智 周延民 杨旭芳
【摘要】 目的： 比较不同离心和激活方法处理富血小板血浆（ PRP） 的效果。方法： 1 名健康志愿者、30 名眼科住院患者静脉 采血，分别用 PCCSkit 法，Curasan 法及 Trindade 法制备 PRP。ELISA 检测各组血小板衍化生长因子（ PDGF） 、转化生长因子 （ TGF-β） 、血管内皮细胞生长因子（ VEGF） ，倒置相差显微镜观察 PRP 添加方式对人成骨样细胞 MG63 观察效果的影响。结 果： Trindade 离心法提取的 PRP 加 CaCl2 后，PDGF 含量高于其他 2 种方法，PCCSkit 法提取的 PRP 加 CaCl2 和凝血酶后，TGFβ 含量高于其他 2 种方法，Curasan 法提取的 PRP 加 CaCl2 后，VEGF 浓度高于其他 2 种方法。3 种离心方法中未激活和激活 的 PRP 中生长因子浓度差异有显著性（ P ＜ 0． 05） ，激活组中 CaCl2 组和 CaCl2 加凝血酶组 PRP 中生长因子含量差异无显著性 （ P ＞ 0． 05） 。显微镜观察显示，PRP 离心后的萃取液可去除 RBC 对 MG63 细胞观察效果的影响。结论： 3 种离心方法间无显 著差异； 低温、即刻提取 PRP，用 CaCl2 或 CaCl2 加凝血酶激活均促进生长因子释放； PRP 离心萃取液更有利于用于细胞培养 中的镜下观察。
浓度为（ 1． 0 ～ 1． 5） × 1012 / L，符合实验要求。3 种离 心方法提取 PRP 后，每种方法又分 3 组： 第 1 组未激 活 PRP； 第 2 组只加 10% CaCl2 激活； 第 3 组加含凝血 酶 500 U / ml 的 10% CaCl2 激活［5］。2 种激活剂均按 9∶1（ v / v） 与 PRP 混合，室温静止 10 min，离心 12 000 r / min，5 min，提取萃取液。ELISA 方法比较不同离心 方法 获 得 的 PRP 经 激 活 处 理 后 其 PDGF、TGF-β、 VEGF 的浓度差异。 1． 2． 2 离心温度比较 抗凝全血分 2 组，每组 5 份， PCCS kit 法提取 PRP，第 1 组常温离心，第 2 组低温离 心控度 20 ℃ 。测量离心管表面温度，比较 2 组差异。 提取 PRP 后，按 9∶1（ v / v） 含凝血酶 500 U / ml 的 10% CaCl2 混合，静 置 10 min，常 温 离 心 12 000 r / min，5 min，提取 PRP 萃取液，比较 2 组的量。 1． 2． 3 保存方法比较 实验分 2 组，PCCS kit 法提取 PRP，第 1 组 2 次离心后即刻加含凝血酶 500 U / ml 的 10% CaCl2 ，12 000 r / min，5 min； 第 2 组 2 次离心后 － 80 ℃ 冻存，实验时，室温溶化后加相同激活剂，同法 高速离心。比较 2 组 PRP 的性状。 1． 2． 4 细胞实验中 PRP 添加方式比较 对数生长期 MG63，胰酶消化，离心 1 000 r / min，5 min，细胞悬液密 度 5 × 104 / ml。24 孔板，每孔加细胞悬液 500 μl。A 组即刻加未激活未离心的 PRP、每孔 25 μl，B 组即刻 加未激活已离心的 PRP、每孔 25 μl，倒置相差显微镜 观察细胞形态。 1． 3 统计学方法
1 材料和方法
1． 1 主要试剂与材料 人成骨样细胞株 MG63 购自中科院上海生物研究
所，CaCl2 （ 北京生化） ，hPDGF、hTGF-β，hVEGF ELISA 试剂盒（ RD，美国） ，10% 胎牛血清（ PAA，奥地利） ，高 糖 DMEM 培养基（ Gibco，美国） ，人凝血酶、胰蛋白酶 （ 鼎国生物） 。常温台式离心机（ 菲恰尔 TDL-4A 型， 上海生物分析仪器有限公司） ，全能台式高速冷冻离 心机（ Thermo，德国 ） ，温度计（ 数字式电子体温计，东 阿阿胶阿华医疗器械有限公司） ，倒置相差显微镜（ Olympus IX70，日本） ，CO2 孵箱（ Thermo，德国） ，无菌采 血管（ 江苏康健） ，超净工作台（ 苏州安泰空气技术有 限公司） ，酶标仪（ BIO-RAD 680 型，日本） 。 1． 2 方法
基金项目： 吉林省科学技术厅项目（ 编号： 200804423） 作者单位： 130021 长春，吉林大学口腔医院种植中心（ 王悦 周延民） ；
吉林大学白求恩医学院病理系（ 朱喆 马英智 杨旭芳） ； 吉 林大学口腔医院第二临床医院检验科（ 刘昕鸣） 通讯作者： 周延民 0431-88796025 E-mail： zhouym62@ 126． com
【Key words】 Platelet-rich plasma； Growth factor； Preparation methods 中图分类号： R331． 1 + 43 文献标识码： A doi： 10． 3969 / j． issn． 1001 － 3733． 2011． 05． 013
Βιβλιοθήκη Baidu
目前，组织工程骨构建与生长因子应用研究多采
【关键词】 富血小板血浆； 生长因子； 制备方法
Comparison of the methods for the preparation of platelet-rich plasma WANG Yue1 ，ZHU Zhe2 ，LIU Xinming3 ，MA Yingzhi2 ，ZHOU Yanmin1 ，YANG Xufang2 ． 1． 130021 Changchun， Department of Implant Center，School of Stomatology，Jilin University，China； 2． Department of Pathobiology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun； 3． Clinical laboratory，The Second Clinical Hospital of Jilin University，Changchun
【Abstract】Objective： To compare the effects of different methods for the preparation of platelet-rich plasma （ PRP） ． Methods： Venous blood was obtained from a health volunteer and 30 patients of the department of ophthalmology． PRP was prepared by PCCS system，Curasan system and Trindade method respectively． The levels of PDGF，VEGF and TGF-β in the PRP samples were measured using ELISA． A phase contrast microscope was used to observe the morphology of MG63 cells cultured with PRP． Results： PDGF level in the PRP prepared by Trindade method and treated with CaCl2 was higher，TGF-β level in PRP prepared by PCCS and treated with CaCl2 and thrombase was higher，the concentration of VEGF in PRP prepared by Curasan and treated by CaCl2 was higher． CaCl2 increased PDGF level in the PRP prepared by Trindade method，TGF-β by PCCS and Curasan，and VEGF by the three methods（ P ＜ 0． 05） ，but the two activation methods showed no statistics significance（ P ＞ 0． 05） ． Centrifuged PRP did not affect the observation of the morphology of cultured MG63 cells． Conclusion： Three methods are effective in the prepariation of PRP． Preparation at low temperature and activation of PRP by CaCl2 or CaCl2 plus thrombin may increase the cytokin content． Centrifuged PRP is suitable for cell culture．
用单一或几个生长因子与材料复合，其中生长因子制 备复杂、成 本 高，受 保 存 条 件 及 免 疫 原 性 局 限。1993 年，Ganio 等［1］将人血浆中提取的富血小板血浆（ platelet-rich plasma，PRP） 用于促进伤口愈合，并指出其潜 在的临床前景。PRP 是患者自体血离心提取的血小板 含量比正常全血高 4 ～ 5 倍的血浆。体外血小板与
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实用口腔医学杂志（ J Pract Stomatol） 2011 Sep，27（ 5）
CaCl2 、凝血酶混合后被激活，其中 α 颗粒释放多种生 长因子如： 血小板源生长因子 （ platelet-derived growth factor，PDGF） 、转化生长-β（ transforming growth factor， TGF-β） 、血 管 内 皮 生 长 因 子 （ vascular endothelial growth factor，VEGF） 、表皮生长因子（ epithelial growth factor，EGF） 、类胰岛素生长因（ insulin-like growth factor，IGF） 、成纤维细胞生长因子 （ fibroblast growth factor，FGF） 等，各因子间发挥协同作用，但机制尚不清。 PRP 因制备简便，价格低，无免疫原性，成为临床理想 的生长因子源。故有必要就 PRP 制备过程的注意事 项，不同离心方法对 PRP 中生长因子含量的影响进行 研究，为阐明 PRP 的生物学机制提供技术方法。
从离心速度、激活方法、离心温度、保存方法等四 方面，探讨 PRP 制备的注意事项； 从 PRP 添加方式对 MG63 镜下观察的影响，探讨 PRP 细胞水平的应用。 1． 2． 1 离心速度、激活方法比较 1 名健康志愿者及 30 名眼 科 住 院 患 者 静 脉 采 血，分 别 采 用： PCCS kit 法［2］，美国 3i 种植公司机采 PRP 设备的离心方法即第 1 次离心 3 000 r / min，3 min 45 s； 第 2 次 3 000 r / min， 13 min。Curasan 法，德国 Kleinostheim 公司机采 PRP 设备的离心方法，第 1 次离心，2 400 r / min，10 min； 第 2 次，3 600 r / min，15 min。Trindade-suedam IK 等报道 的方法（ Trindade 法） ［3］： 第 1 次离心 1 600 r / min，10 min； 第 2 次离心 5 000 r / min，5 min。离心后三者采取 同样的方式提取 PRP，第 1 次离心后收集全部血浆层、 白膜层及 2 ～ 3 mm 范围的红细胞层移至另一采血管； 第 2 次 离 心 后 抽 取 3 /4 血 浆 层，即 贫 血 小 板 血 浆 （ platelet-pool plasma，PPP ） ，余 下 的 1 /4 即 PRP［4］， － 80℃ 冻存。3 种方法离心获得的 PRP 经检验血小板